[发明专利]一种PRRSV弱病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种PRRSV弱病毒及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。该PRRSV弱病毒的N蛋白中的第78位点氨基酸突变为丙氨酸。该PRRSV弱病毒有效降低了病毒的复制能力。该PRRSV弱病毒的制备方法利用PCR，通过特定的引物，定点突变目标序列，得到突变序列，再通过与载体的连接、转化、提取阳性载体，以及采用不同的限制性内切酶进行多次酶切，最终得到含有突变序列的病毒全长序列的感染性克隆载体。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种PRRSV弱病毒及其制备方法和应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称蓝耳病，主要会导致母猪早产、流产、产死胎或木乃伊胎，仔猪和育成猪出现呼吸道疾病，且死亡率高。PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的，PRRSV是呈单股正链的RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属。根据抗原性和序列的不同，将全球的PRRSV分为以VR-2332为代表的美洲型(North American，NA)和以Lelystad virus(LV)为代表的欧洲型(European，EU)。我国流行的PRRSV主要属于美洲株(PRRSV-2)。PRRSV对全球养猪业都是巨大的威胁，2005年美国生猪产业因PRRSV造成的经济损失达到5、6亿美元，其中在母猪繁殖阶段损失6700万美元，断奶仔猪损失了2.01亿美元，而生长育肥猪损失最严重，高达2.92亿美元。2013年，Holtkamp等估算PRRSV对美国生猪业造成的经济损失达到了6.63亿美元。2006年，在我国爆发以JXA1为代表的高致病型PRRSV，因其高致病性和高死亡率，引起了社会的广泛关注。近年来，以GM2、NADC30和NADC34为代表的新型PRRSV毒株的出现，进一步加大了我国防控PRRSV的难度。因此，加强对PRRSV的相关研究对于防控PRRSV，减少其带来的损失具有重要意义。

目前，疫苗是防控PRRSV的主要手段，其中，大部分的PRRSV疫苗属于弱毒活疫苗，很多弱毒疫苗均来源于强毒株在Marc-145细胞等上的连续传代后致弱形成的。这种方法所制备的弱毒活疫苗，因其致弱机制不清晰、病毒致弱时间较长、病毒毒力容易返强等缺陷，急需改进。因此，找出一种更加合理、安全的弱病毒及其制备方法对于防控PRRSV有重要作用。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种PRRSV弱病毒，该PRRSV弱病毒的N蛋白中的第78位点氨基酸突变为丙氨酸，有效降低了病毒的复制能力。

为了达到上述目的，本发明提供一种PRRSV弱病毒，该PRRSV弱病毒的N蛋白中的第78位点氨基酸突变为丙氨酸。

PRRSV基因组全长约15.1kb，具有10个开放阅读框(Open reading frames，ORFs)，包括ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b和ORFs3-7以及ORF5a。与复制酶相关的基因ORF1a和ORF1b编码病毒的非结构蛋白(nsps)其余的ORFs编码病毒的结构蛋白，分别为GP2a、E、GP3、GP4、GP5、M、N以及GP5a。而突变某些病毒蛋白的关键氨基酸位点，可以有效的降低病毒的复制能力和致病性，核衣壳(N)蛋白是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的主要蛋白之一，由ORF7编码。在病毒的生命周期中起着重要作用如调节宿主的细胞因子水平，与其他病毒蛋白相连并与病毒的RNA结合。这表明，该蛋白在病毒的生命活动中起到重要的作用。为此，本发明人从N蛋白出发，通过一系列实验发现N蛋白的78位点能够抑制N蛋白诱导宿主细胞表达IL-10mRNA的能力，因此，突变N蛋白的第78位点的丝氨酸能有效降低病毒的复制能力。

本发明还提供了所述PRRSV弱病毒的制备方法，包括以下步骤：构建PRRSV病毒的N蛋白的serine⁷⁸突变的反向遗传系统，使N蛋白的第78位点氨基酸突变为丙氨酸。