[发明专利]一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体、制备方法和应用

说明书

本发明提供一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体，所述纳米抗体靶向的是PRV的gB蛋白和gC蛋白的优选抗原表位融合蛋白，将其命名为PRV‑BC21，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。通过对比试验证明在PRV检测中纳米抗体PRV‑BC21比商品化的单克隆抗体更灵敏，纳米抗体PRV‑BC21与胶体金标记技术相结合，灵敏度高，检测PRV的检测限可达到1ng/mL。特异性强，交叉反应少。首次开发的胶体金试纸条实现了快速检测，将原本耗时两天的免疫鉴别试验缩短为几分钟完成的快速检测，实现了对PRV快速检测的初步应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种猪伪狂犬病毒(PorcinePseudoraibies Virus，PRV)的特异性检测方法，其活性单元为靶向猪伪狂犬病毒(PorcinePseudoraibies Virus，PRV)gB和gC蛋白的纳米抗体、制备方法和应用。

背景技术

猪伪狂犬病(Porcine Pseudoraibies，PR)是猪的一种急性传染病，又称Aujeszky病，由猪伪狂犬病毒(Porcine Pseudoraibies Virus，PRV)引起。猪作为PRV的天然宿主，对病毒感染更为敏感，是可在急性感染中存活并具有潜伏感染力的唯一动物物种。感染后新生仔猪以高死亡率与神经系统紊乱为特征，怀孕母猪出现流产与繁殖障碍，老年猪以呼吸道疾病为主，以神经症状为特征的仔猪死亡率大于20％，猪感染野生型病毒的几率高达50％，使我国养猪业损失巨大。

PRV属于疱疹病毒科(Herpesviridae)，α-疱疹病毒亚科(Alpha Herpesvirinae)的成员，基因组为线性双链DNA，大小约150kb。PRV目前已知的只有一种血清型，PRV共编码70多种蛋白，主要蛋白除gG蛋白外，其余10个(gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK、gL、gM、gN)均为囊膜结构蛋白。gB、gH、gL和gM蛋白在疱疹病毒科中比较保守，而且gB、gH和gL对所有疱疹病毒在细胞培养物中的复制都是必需的。gB蛋白能够诱导中和抗体的产生，与免疫保护相关。gE蛋白最早被称为gI蛋白。1960年筛选制备的PRV疫苗株如Bartha株及BUK株等均存在gE基因缺失。20世纪80年代中期，通过DNA重组技术构建了gE基因缺失的PRV突变株；在此基础上，将TK基因进行缺失使PRV病毒得到进一步弱化。许多gE基因缺失疫苗均能够预防攻毒感染或减轻攻毒感染所造成的临床症状，在许多国家允许猪群使用gE基因缺失疫苗。

从敏感性与特异性上来说，病毒的分离与鉴定是检测PRV的黄金标准，但该分耗时长(至少2-3天)，且灵敏度较低，且需要较高的细胞培养水平，病毒培养过程也易出现细节性操作失误而最终影响诊断结果，因此很难在基层兽医单位得到推广。病毒中和试验(VNT)为PRV检测中常用的方法之一，此方法高效且敏感。但是，在感染的急性阶段此方法敏感性低，而且容易使结果呈现假阴性。间接夹心ELISA等免疫学诊断方法虽然具有很高的灵敏性和很强的特异性，但需要较多纯度的蛋白，且需要精细操作且易出现假阳性，尤其依赖敏感性和特异性高的检测抗体，可以说检测抗体的性质就直接决定了检测的准确性和精度。而且上述这些方法虽然可以检测PRV病毒，在实践中也取得一定的效果，但存在实验操作复杂，耗时长，需要相互匹配的检测试剂以及相关的仪器设备来进行，且仅限于在实验室内进行，难以普及推广。因此，研制开发快速、简便的PRV病毒检测方法，对于病毒增殖的实时监测具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病毒(PorcinePseudoraibies Virus，PRV)的快速特异性检测方法，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体，所述纳米抗体靶向的是PRV的gB蛋白和gC蛋白的优选抗原表位融合蛋白，将其命名为PRV-BC21，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，本发明提供一种纳米抗体PRV-BC21的制备方法，包括以下步骤：