[发明专利]一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法

权利要求书

1.一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将目的基因与载体连接，转化到感受态DH5α；

（2）对转化后的DH5α扩大培养，提取质粒；

（3）将获得的质粒转染293T细胞，获得慢病毒液；

（4）利用PTG8000浓缩病毒液的方法浓缩病毒液；

（5）利用电转仪通过电转的方式将浓缩病毒转入Raw264.7细胞；

（6）稳定表达细胞的筛选；

（7）细胞扩增；

（8）获得稳定高表达目的基因的Raw264.7细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，其特征在于：所述Raw264.7细胞为宿主细胞。

3.根据权利要求1所述的一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，其特征在于：所述步骤（3）的具体步骤包括：

a）转染前24h用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，接种于10cm大皿中，37℃、5%CO2培养箱内用10%血清的DMEM培养基培养；

b）取2个无菌1.5mL离心管置于离心管架分别A管和B管，取650uLOpti-MEM 加入到两个离心管，取36μl Lipofectamine 2000于A管中，分别取8ug质粒 3*FLAG-PPARγ-EGFP、6μgPLP1、6μg PLP2、6μg VSVG 加入B管中，室温静置5min；

c）将长至80%的293T培养基弃掉，PBS清洗后换成Opti-MEM培养基培养；

d）5min后，将A、B两管混合，室温静置20min；

e）将A、B混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养；

f）培养6 h后弃去含有A、B混和物的培养基， PBS清洗，加入含10%灭活血清的DMEM细胞培养基6 ml，于37℃、5% CO2培养箱内继续培养48 h；

g）收集上清，1000 rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液用0.45 μm PVDF滤器过滤至5ml圆底离心管中。

4.根据权利要求1所述的一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，其特征在于：所述步骤（5）的具体步骤包括：

a）将长至70%-80%的两皿Raw264.7细胞拿到安全柜中，吹打下细胞，收集细胞沉淀，230g，3min离心；

b）弃上清，PBS清洗一遍，分装为两管，230g，3min离心，弃上清；

c）电转缓冲液为PBS和灭活的胎牛血清，用1mL血清/PBS重悬，计数，取5×106 个细胞于10 μl病毒浓缩液中吹打均匀，使用电极杯配套吸管加入到2mmBTX电极杯中，设置电压为200V，脉冲长度为8毫秒，脉冲数量为1，脉冲场强为1000V/cm，总样本体积为200µl，温度为室温；

d）将电转后的细胞悬液吸出加入含有1mL灭活的胎牛血清的六孔板中，37℃、5% CO2培养箱内中培养。