[发明专利]一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法

说明书

一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法：将质粒转化到感受态DH5α；对转化后的DH5α扩大培养，提取质粒；将转后的大肠杆菌进行质粒提取，获得将目的基因与载体连接，转化到感受态DH5α；对转化后的DH5α扩大培养，提取质粒；将获得的质粒转染293T细胞，获得慢病毒液；利用PTG8000浓缩病毒液的方法浓缩病毒液；利用电转仪通过电转的方式将浓缩病毒转入Raw264.7细胞；稳定表达细胞的筛选；细胞扩增；获得稳定高表达目的基因的Raw264.7细胞株。本发明利用电转仪解决了Raw264.7细胞难感染，难以构建稳定高表达细胞株的问题，操作简便，可以在短时间内获得稳定高表达某基因的Raw264.7细胞株。

技术领域

本发明涉及分子生物技术及基因工程领域，尤其是一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法。

背景技术

腹膜透析对于终末期肾病患者来说是一种成功的肾脏替代疗法，而腹膜炎是导致腹膜透析失败甚至患者死亡的主要原因，外界病原体的侵入，诱导巨噬细胞及白细胞等侵入腹膜。

巨噬细胞是属于吞噬细胞的一种细胞，是人体免疫系统的主要成员之一，能识别不同的病原微生物，并且能够快速做出有效反应,起到清除病原体的作用,是机体抵御外来感染的第一道防线。

PPARγ即过氧化物酶体增殖物活化受体γ，是一种核激素受体超家族中的脂肪酸激活转录因子，经研究，PPARγ在许多炎症疾病包括腹膜炎，脑损伤中的炎症，肺炎，肠炎，乳腺炎等许多不同部位的炎症中，PPARγ都起着抗炎的作用。因此，通过研究PPARγ是否以外泌体的形式从巨噬细胞中分泌出来，以及进一步研究分泌的PPARγ调控腹膜炎性损伤的机制研究能够从机体防御的角度，为腹膜炎的预防及治疗提供新的思路。

在该研究过程中，在巨噬细胞Raw264.7细胞中构建PPARγ稳定高表达的细胞株是实验开展的基础，然而，慢病毒感染Raw264.7十分困难，因此，提供一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达PPARγ的细胞株的方法并进行应用是需要解决的一个技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，解决了Raw264.7难感染的问题。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，包括以下步骤：

（1）将目的基因与载体连接，转化到感受态DH5α；

（2）对转化后的DH5α扩大培养，提取质粒；

（3）将获得的质粒转染293T细胞，获得慢病毒液；

（4）利用PTG8000浓缩病毒液的方法浓缩病毒液；

（5）利用电转仪通过电转的方式将浓缩病毒转入Raw264.7细胞；

（6）稳定表达细胞的筛选；

（7）细胞扩增；

（8）获得稳定高表达目的基因的Raw264.7细胞株。

慢病毒感染并非平常的感染，而是将包装好的慢病毒颗粒在借助外力的作用下（电转仪），通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的病毒颗粒，实现构建稳定高表达目的基因的细胞株。本发明其能够实现目标基因PPARγ的稳定过表达，进而为在Raw264.7细胞中研究PPARγ的分泌，以及分泌的PPARγ调控腹膜炎性损伤的机制研究提供了实验材料，且该细胞株过表达PPARγ稳定，可以用于定量和定性检测PPARγ过表达状态下相关蛋白质的表达情况。

作为改进，所述Raw264.7细胞为宿主细胞。

作为改进，述步骤（3）的具体步骤包括：

a）转染前24h用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，接种于10cm大皿中，37℃、5%CO2培养箱内用10%血清的DMEM培养基培养；