[发明专利]含高效价抗HCMV中和抗体原料血浆的筛选方法和抗HCMV中和抗体效价的检测方法

权利要求书

1.一种含高效价抗HCMV中和抗体原料血浆的筛选方法，其包括以下步骤：

S1：准备一份HCMV病毒稀释液，其与等体积的含有已知抗HCMV中和抗体量的抗HCMV免疫球蛋白国家标准品恰好中和；

S2：根据步骤S1的已知抗HCMV中和抗体量和含高效价抗HCMV中和抗体原料血浆的效价筛选标准确定对待筛选原料血浆的稀释倍数，按照确定的稀释倍数稀释所有待筛选的原料血浆，获得待检血浆样品；

S3：将步骤S2获得的待检血浆样品与等体积的HCMV病毒稀释液进行充分混匀，获得病毒-样品混合液，置于培养箱中感作；

S4：取步骤S3感作结束后的病毒-样品混合液，并向其中加入MRC-5细胞悬液，获得培养体系，于培养箱中培养48±2h；

S5：步骤S4培养结束后，使所述培养体系经历以下操作：去除培养体系中的培养液、第1次PBS漂洗、固定、第2次PBS漂洗、通透、第3次PBS漂洗、封闭液封闭和室温孵育，获得孵育体系；

S6：向步骤S5的孵育体系中加入抗HCMV gB糖蛋白抗体作为特异性一抗，孵育和漂洗后，加入荧光标记的相应二抗，再次进行孵育和漂洗，获得待检血浆样品观察板；

S7：将步骤S6获得的待检血浆样品观察板置于免疫斑点分析仪中计数，板中出现的荧光斑点数目不超过20个，优选板中不出现荧光斑点的孔所对应的待筛选原料血浆即为含高效价抗HCMV中和抗体的原料血浆。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，步骤S5中所述固定的条件为：采用0.18％-0.22％戊二醛固定50min-70min。

3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，步骤S3中所述置于培养箱中感作的具体操作为：37±1℃、5％CO₂培养箱中感作0.9～1.1h。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的筛选方法，步骤S4中所述MRC-5细胞悬液通过以下方式获得：取对数生长期的MRC-5细胞，使用胰酶进行常规消化，使用含5％胎牛血清的MEM培养液调整细胞密度，获得MRC-5细胞悬液；和/或

步骤S4中所述培养体系为病毒-样品混合液病毒-样品混合液与MRC-5细胞悬液等体积混合得到；和/或

步骤S4中所述培养箱中培养的条件为37±1℃、5％CO₂。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的筛选方法，步骤S5中使所述培养体系具体经历以下操作：去除培养体系中的培养液，PBS漂洗3次；加入0.18％-0.2％戊二醛固定50min-70min；用PBS漂洗3次；加入0.1％Triton-X 100通透15min，用PBS漂洗3次；加入200μL/孔封闭液(含1％BSA的PBS)进行封闭，室温孵育60min。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的筛选方法，步骤S6的具体操作为：向步骤S5的孵育体系中加入抗HCMV gB糖蛋白抗体作为特异性一抗，37℃孵育120min，用PBS漂洗3次；加入荧光标记的相应二抗，37℃避光孵育30min，用PBS漂洗3次，获得待检血浆样品观察板。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的筛选方法，步骤S7中具体使用Immunospot分析软件对由免疫斑点分析仪获得的ELISPOT图像进行荧光斑点计数分析。