[发明专利]含高效价抗HCMV中和抗体原料血浆的筛选方法和抗HCMV中和抗体效价的检测方法

说明书

本发明公开了一种含高效价抗HCMV中和抗体原料血浆的筛选方法和抗HCMV中和抗体效价的检测方法，属于血液制品技术领域。本发明提供的筛选方法和检测方法均基于荧光免疫斑点试验，包括利用能与含有已知抗HCMV中和抗体量的抗HCMV免疫球蛋白国家标准品恰好中和的HCMV病毒稀释液与按照确定的倍数稀释的待检血浆样品或系列梯度稀释的待检样品进行荧光免疫斑点试验。本发明提供的方法仅需要48h左右就可以获得结果，并且结果数据由免疫斑点分析仪采集分析，无需肉眼观察，对结果的判定更加客观准确。

技术领域

本发明属于血液制品检测技术领域，具体涉及一种含高效价抗HCMV(人巨细胞病毒) 中和抗体原料血浆的筛选方法和样品中抗HCMV中和抗体效价的检测方法，尤其涉及一种对含高效价抗HCMV中和抗体的巨细胞病毒免疫球蛋白制备用原料血浆的快速、客观、准确筛选方法和样品(例如血液制品、原料血浆或其组合)中抗HCMV中和抗体效价的快速、客观、准确检测方法。

背景技术

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)是疱疹病毒科β属的DNA病毒，在人群中极为普遍，大多为无症状的隐性感染。但对于免疫力低下人群(如骨髓和实体器官移植受者、HIV感染者和肿瘤患者)，HCMV感染会引起严重的HCMV临床并发症(如肺炎、肝炎、肾炎等)，也会导致器官移植失败；孕妇原发或复发HCMV感染会引起新生儿宫内感染或围产期感染侵袭胎儿，导致流产、死胎、胎儿畸形、发育迟缓等严重后果。国外临床上广泛使用抗病毒药物联合巨细胞病毒特异性人免疫球蛋白(CMVIG)防治实体器官移植患者术后HCMV感染及相关疾病。

作为防治HCMV感染的有效手段，国外已有CMVIG相关产品上市，但国内目前尚无上市产品。CMVIG是将通过一定的筛选方法及其相应的筛选标准筛选获得的含高效价抗HCMV中和抗体的健康人血浆进行混合后，以Cohn氏低温乙醇法及病毒灭活等工艺制备而成的免疫球蛋白制剂。因此，建立含高效价抗HCMV中和抗体的原料血浆筛选方法是制备CMVIG 的前提和保证。

目前针对抗HCMV抗体效价水平的检测方法通常有ELISA法、微量细胞病变中和试验法和快速微量中和试验法，其中ELISA方法的抗原抗体反应并不能反映原料血浆等样品中抗 HCMV中和抗体效价的真实水平，因而不适用于原料血浆等样品中抗HCMV中和抗体效价的检测以及含高效价抗HCMV中和抗体的健康人血浆的筛选(杨春等，人巨细胞病毒中和抗体快速微量检测方法的建立及应用，中国输血杂志，2012年2月第25卷第2期，以下称文献1)。微量细胞病变中和试验法是较为直观的抗体中和效价测定方法，但是实验周期较长(参见文献1)，通常需要7～10天后才能判定结果(例如CN103554252A，以下称文献2)。快速微量中和试验法(参见文献1)与微量细胞病变中和试验法相比可极大缩短实验周期(约48h可获得检测结果)，但此两种试验方法对结果的判定均是基于通过显微镜观察细胞病变，对实验人员的专业能力和经验要求较高，主观性较强。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种含高效价抗HCMV 中和抗体原料血浆的筛选方法，其包括以下步骤：

S1：准备一份HCMV病毒液(例如滴度为4000-6000TCID₅₀/0.1mL的HCMV病毒液)，其感染MRC-5细胞48h后可通过荧光免疫斑点试验检测到HCMV gB糖蛋白的表达，采用等体积的含已知抗HCMV中和抗体量(例如约25U/mL)的抗HCMV免疫球蛋白国家标准品可将其恰好中和；

S2：根据步骤S1已知的可恰好中和HCMV病毒液的抗HCMV中和抗体量以及含高效价抗HCMV中和抗体原料血浆的筛选标准，可确定待测血浆样品的稀释倍数，按照确定的稀释倍数稀释所有待测血浆样品，获得待测血浆样品稀释液；

S3：将步骤S2获得的待测血浆样品与等体积的HCMV病毒液进行充分混匀，获得病毒 -样品混合液，置于培养箱中感作；同时设置仅加HCMV病毒液的病毒对照和仅加培养液的空白对照；