[发明专利]一种检测5种鹅膏肽类毒素、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法

说明书

本申请提供一种检测5种鹅膏肽类毒素、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法，该方法通过实验条件的优化，首次建立了超高效液相色谱‑质谱、质谱法同时测定蘑菇中3种鹅膏毒肽和2种鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺含量的方法，检测灵敏度高，回收率均值为71.8%~117%，相对标准偏差（RSD）为1.73%~9.92%，本方法的重现性和准确度均理想，满足实际样品的分析要求，为突发公共卫生事件处置提供科学依据。

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的检测方法。

背景技术

蘑菇属于大型真菌，包括野生食用菌和药用菌，其中少数为毒蘑菇。毒蘑菇含不同类型致害毒素。19世纪60年代，人类首次从毒蝇鹅膏菌Amanita muscaria(L.)发现有毒毒素。目前已报道了毒蘑菇含九大类毒素：鹅膏毒环肽、单甲基肼毒素、丝膜菌毒素、毒蝇碱、鹅膏蕈氨酸、鬼伞菌素、裸盖菇素和脱磷酸裸盖菇素、胃肠道刺激剂以及亚稀褶黑菇毒素。毒蘑菇毒素致毒症状分为胃肠型、神经型、溶血型、肝脏损害型、呼吸与循环衰竭型和光过敏性皮炎型等6大中毒症状。

鹅膏肽类毒素是导致蘑菇中毒死亡的主要毒素，深受人们关注，对此发展出了诸多检测方法，包括显色法，色谱质谱法，免疫检测法等。但实际应用中还存在一些问题，显色法虽然简单快速但是灵敏度低，检测对象有限。免疫检测法简单且灵敏度高，但检测毒素种类少且只能定性，应用范围有限。色谱-质谱法的效果最佳，不仅灵敏度高，检测对象广，还能定性定量。但是除了鹅膏肽类，还存在其他蘑菇毒素能够导致中毒，而目前用色谱-质谱法对鹅膏肽类及其他蘑菇毒素同时检测的方法较少。

之前的研究表明，鹅膏肽类毒素常采用反相色谱法进行保留，而神经精神型蘑菇毒素多采用亲水作用进行保留。但部分神经精神型毒素极性差异较大，具备在反相色谱上保留的能力。同时T3色谱柱比传统C₁₈增加了极性基团修饰，显著增强对极性分子的反相保留能力，因此存在将鹅膏肽类和神经精神型毒素同时保留在反相色谱上的实验基础。在前处理部分，我们考虑了色胺类蘑菇毒素容易形成阳离子化合物而鹅膏肽类毒素易被反相保留，故主要选取具有阳离子交换和非极性双重性的固相萃取小柱作为净化材料。最终，我们建立了一种能同时检测5种鹅膏肽类(3种鹅膏毒肽和2种鬼笔毒肽)、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服发生蘑菇中毒时，蘑菇中含有多种类型毒素，常规检测方法无法覆盖检出的问题，提供一种快速有效检测食品中5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的定性定量检测方法。

一种5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的检测方法，包括如下步骤：

(1)标准溶液的配制

将α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺毒素标准品配制成标准储备液、使用液；将内标脱磷裸盖菇素-d₁₀、蟾蜍色胺-d₄配制成内标使用液。

(2)标准曲线的制作

吸取上述标准使用液适量，用空白样品基质配制成系列浓度的标准工作液，经UPLC-MS/MS分析，以5种鹅膏肽类毒素以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线，脱磷裸盖菇素与蟾蜍色胺以定量离子峰面积与对应内标的峰面积比值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线。

(3)样品前处理

称取蘑菇干粉样品，进行前处理，得带测定的样品，其中，前处理的方法包括：

将蘑菇干粉用甲醇超声提取，旋蒸至干，复溶；用强阳离子交换固相萃取小柱净化后，氮气吹干、定容、涡旋混匀、离心取上清，得待测定的样品。

(4)测定

a、色谱条件：