[发明专利]一种猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法

说明书

本发明提供了一种基于豚鼠DTH的猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法，包括向豚鼠皮下注射猪支原体肺炎灭活疫苗并加强免疫后，注射猪肺炎支原体抗原诱导DTH反应，根据形成的红斑大小计算硬结反应直径，进而评估疫苗效力的步骤。本发明相比于免疫攻毒法、IHA法，成本低廉、操作简便、能很好的反应疫苗免疫后的细胞免疫应答水平，是一种针对猪支原体肺炎疫苗免疫后效果评估的新方法。

技术领域

本发明涉及疫苗效力评估领域，具体涉及一种猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法。

背景技术

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，MHP)可引起猪只的支原体肺炎(Mycoplasmal pneu-monia of swine，MPS)，该病的流行与存在长期困扰着世界各地养猪业的健康发展。该病具有发病率高、死亡率低的特点，是一种猪慢性接触性呼吸道传染病。疫苗接种是预防和净化猪支原体肺炎的最有效手段。目前市售疫苗主要有灭活疫苗和活疫苗，其中灭活疫苗以体液免疫为主，活疫苗以细胞免疫为主。

传统猪支原体肺炎疫苗的效力检验方法包括免疫攻毒法、间接血凝试验(IHA)法。其中免疫攻毒法是通过针对猪只免疫后用强毒攻毒，然后观察肺脏胰样肉变的情况来判定疫苗免疫后保护效果，该方法可以直观有效的判断出疫苗免疫保护效果，但其成本较高且通过肉眼观察病变的方式容易受到人为因素干扰。IHA法是通过检测疫苗免疫大耳白兔后抗体水平的高低从而判定疫苗免疫后保护效果，该方法可以直接反映免疫后血清中抗体水平的高低，但其容易受到试剂盒检测中试剂的干扰且成本依旧较高。

迟发型超敏反应(DTH)，是由效应性T细胞与相应抗原作用后，引起的以单个核细胞浸润和组织细胞损伤为主要特征的炎症反应，猪肺炎支原体(MHP)感染后细胞免疫能力下降，但是通过疫苗免疫后能显著增加细胞免疫水平，且产生的CD4⁺T细胞多于CD8⁺T细胞，当MHP抗原再次刺激机体后，由CD4⁺T细胞释放的大量细胞因子可导致明显的炎性反应，最终导致以单个核细胞浸润为主的炎症反应及细胞变性坏死。根据炎性反应强烈程度可以一定程度上反推细胞免疫水平从而评价疫苗免疫效果。

然而，对于炎症反应强烈程度的判断目前仍掺杂较多人为主观因素，尚无系统、标准化的，并且检测结果准确的检测方法报道，若能提供基于DTH的检测方法，将有利于降低成本，为猪支原体肺炎疫苗的效力评估提供新的选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于DTH的猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法。

本发明提供了一种猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法，包括如下步骤：

(1)向豚鼠皮下注射猪支原体肺炎灭活疫苗，注射后10～21日以相同剂量第二次注射疫苗加强免疫；

(2)第二次注射疫苗后10～30日，向豚鼠背部不同部位皮内注射等体积的不同检测试剂，所述检测试剂包括：植物血球凝集素溶液和猪肺炎支原体抗原溶液；所述肺炎支原体浓度为10^9.0～10^10.0CCU/ml；

(3)注射后24小时，分别测量和计算不同检测试剂注射部位出现的红斑大小，计算硬结反应比值；所述硬结反应比值的计算方法为：

r＝d_s/d₀

其中r是硬结反应比值，d_s是注射猪肺炎支原体抗原溶液部位的红斑大小，d₀是注射植物血球凝集素溶液部位的红斑大小。

进一步地，上述红斑大小是指平均红斑直径或红斑面积；

优选地，所述平均红斑直径的计算方法为：

d＝(d₁+d₂)/2，