[发明专利]基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法

说明书

本发明公开了一种基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，包括以下步骤：1)干血斑样本前处理：1‑1)萃取：从干血斑样本上取血片，加入内标萃取液，震荡；1‑2)氮吹：离心，然后氮吹干；1‑3)衍生：加入含盐酸羟胺的乙腈水溶液，混匀，然后恒温衍生，制得测试样；2)采用液相色谱串联质谱的方法对测试样进行检测，通过标准曲线计算得到待测干血斑样本中的12种类固醇激素的含量。本发明采用的干血斑采样具有极小的侵入性、样品采集简便，可以有效去除生物样本的基质效应，干血斑的运输和储存便利；本发明通过羟胺衍生可以提高羰基类固醇激素的离子化效率，通过流动相中加入氟化铵可以改善羟基类固醇的电离过程。

技术领域

本发明涉及临床质谱体外检测技术领域，特别涉及一种基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法。

背景技术

类固醇激素包括糖皮质激素、盐皮质激素和性激素，其生理功能主要表现在调节糖代谢、调节水盐代谢以及调节性腺功能，对生命维持、机体发展、免疫调节、性功能调节和生育控制方面有明确的作用。通过LC-MS/MS进行类固醇分析已被广泛应用于先天性肾上腺皮质增生、原发性醛固酮增多症、库欣综合征、多囊卵巢综合征等疾病的筛查。

目前，临床中多通过液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取等方式处理人血清或血浆样本进行内源性的类固醇激素分析，但进行血清或血浆类固醇分析需要进行侵入性的静脉采血和样本采集，必须在短时间内低温下进行样本的保存和运输，非常不方便在临床中展开应用。对比而言，干血斑(DBS)是样本采集和保存的一个不错的选择。然而，干血斑技术在内源性类固醇激素的样本分析中却鲜有报道。专利CN 107462653A公开了一种干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，其用甲醇萃取干血片后即可进行分析，但指标的离子化效率不高，检测下限无法满足临床需求。

所以，现在需要提供一种更可靠的方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，包括以下步骤：

1)干血斑样本前处理：

1-1)萃取：从干血斑样本上取血片置于容器中，加入内标萃取液，震荡；

1-2)氮吹：离心，然后氮吹干；

1-3)衍生：向步骤1-2)得到的产物中加入含盐酸羟胺的乙腈水溶液，混匀，然后恒温衍生，制得测试样；

2)采用液相色谱串联质谱的方法对测试样进行检测，通过标准曲线计算得到待测干血斑样本中的12种类固醇激素的含量；

其中，所述12种类固醇激素包括：双氢睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、皮质酮、可的松、雌酮、雌二醇、雌三醇、17-羟孕烯醇酮、醛固酮和雄烯二酮。

优选的是，所述步骤1)具体包括：

1-1)萃取：从干血斑样本上取若干个血片置于离心管中，加入内标萃取液，室温下300-1500rpm下震荡20-80min；

1-2)氮吹：2500-10000rpm下离心2-10min，得到提取液，然后将提取液转移到新的离心管中，然后氮吹干除去溶剂；

1-3)衍生：向步骤1-2)得到的产物中加入含50-200mM盐酸羟胺的乙腈体积分数为15-60％的乙腈水溶液，300-1500rpm下混匀0.5-2min，然后在40-70℃下恒温衍生15-60min，制得测试样。

优选的是，所述步骤1)具体包括：