[发明专利]筛选经CYP3A7介导代谢毒性外源化合物的细胞模型及其构建方法、应用

说明书

本发明公开了一种筛选经CYP3A7介导代谢毒性外源化合物的细胞模型及其构建方法、应用。所述的一种筛选经CYP3A7介导代谢毒性外源化合物的细胞模型，其特征在于：采用Flp‑In^TM‑CHO作为目的细胞，将含有CYP3A7和POR的编码DNA序列分别转染入目的细胞，得到所述筛选胎儿代谢毒性外源化合物的细胞模型。本发明所建立的模型新颖、可靠、简便，可极大提高经CYP3A7介导的外源化合物代谢毒性筛选细胞模型的灵敏性。

技术领域

本发明涉及药物毒理学技术领域，具体涉及一种筛选经CYP3A7介导代谢毒性外源化合物的细胞模型及其构建方法、应用。

背景技术

外源化合物代谢毒性是指外源化合物本身没有毒性或毒性较低，经过机体的代谢会产生毒性更强的的中间代谢物或副产物对机体造成损害，称之为代谢毒性(或代谢损伤)，如黄曲霉素、苯并芘、对乙酰氨基酚等外源化合物均通过细胞色素P450(CytochromeP450,CYP450)超家族代谢生成致毒甚至致癌的代谢物发挥毒性作用。CYP是介导外源化合物代谢毒性的主要代谢酶之一，CYP3A4是成人表达量最高也是参与外源化合物代谢最多的CYP亚型，而CYP3A7主要在胎儿组织表达。CYP3A7主要在胎儿组织表达，出生后表达开始降低但在1岁之内仍是主要的表达酶。确定新生儿期、婴儿期和儿童期患者的药物剂量很复杂，因为脏器大小、酶活性和体重之间没有相关性可以反映年龄相关的药物代谢能力差异。

目前对代谢毒性的评价手段大多是将整体动物脏器损伤结果和基因/蛋白-代谢物结合物作为外源化合物发育毒性的衡量指标，但存在动物用量大、检测方法要求高、灵敏度低等缺点，而已有的外源化合物代谢毒性的体外评价体系，如HepaRG或肝瘤细胞系，前者价格昂贵且不能传代成本太高，后者因为代谢酶基础表达低需转染随机插入CYP的DNA序列，影响不同时期不同实验室的检测重复性。综上，外源化合物代谢毒性体外评价体系存在较大局限，灵敏度高、成本低、重复性好的外源化合物代谢毒性体外评价体系尚待开发。

Flp-In^TM-CHO细胞系来源于赛默飞世尔科技公司(货号:R75807)，在转录活性基因组基因座处包含一个稳定整合的FRT位点。构建含有CYP3A7编码DNA序列的Flp-In^TM表达载体和Flp-In重组酶载体pOG44共转染Flp-In^TM-CHO，可以在每个细胞中将CYP3A7表达载体靶向整合到同一个位点中，确保不同时期或不同实验室都能得到均一CYP3A7表达水平的细胞模型。文献报道的其它类似代谢毒性评价细胞模型体系是否表达POR也并不清楚。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种筛选经CYP3A7介导代谢毒性的外源化合物的细胞模型，所用细胞为Flp-In^TM-CHO细胞系来源于赛默飞世尔科技公司(货号：R75807)，来自于中国仓鼠卵巢，不涉及复杂伦理问题并可多次传代，转录活性基因组基因座处包含一个稳定整合的FRT位点，可以在每个细胞中将CYP3A7表达载体靶向整合到同一个位点中。共转染POR后可极大提高对经CYP3A7介导代谢毒性的外源化合物的敏感性。所述模型以细胞活力为检测指标，是一个方法简单、成本低、敏感、快速的检测模型。

本发明目的之二在于提供一种筛选经CYP3A7介导代谢毒性的外源化合物的细胞模型的构建方法，所述造模方法简单，可重复性强。

本发明目的之三在于提供一种筛选经CYP3A7介导代谢毒性的外源化合物的细胞模型在检测具有代谢毒性的外源化合物中的应用，所述模型检测过程快速，应用范围广，可用于高通量筛选。

本发明实现目的之一采用以下技术方案：

一种筛选经CYP3A7介导代谢毒性外源化合物的细胞模型，其特征在于：采用Flp-In^TM-CHO作为目的细胞，将含有CYP3A7和POR的编码DNA序列分别转染入目的细胞，得到所述筛选胎儿代谢毒性外源化合物的细胞模型。