[发明专利]一种巨噬细胞特异性USP13过表达的重组腺相关病毒及其应用

说明书

本发明涉及一种巨噬细胞特异性USP13过表达的重组腺相关病毒，构建方法：体外克隆USP13基因，将USP13基因和pAAV‑Lyz2载体分别用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切，然后DNA连接，得到含有USP13的重组穿梭质粒，扩增、提纯后，将重组穿梭质粒和pHelper和pAAV‑RC质粒混合，共转染AAV‑293细胞，培养后收获细胞，反复冻融后过滤，获得病毒液，纯化后即得。该病毒带有巨噬细胞特异性启动子Lyz2和USP13基因表达序列，可在体内巨噬细胞中特异性过表达USP13蛋白并靶向修饰下游IκBα蛋白泛素化水平，抑制下游NF‑κB通路，促进巨噬细胞M2极化，改善脊髓损伤功能。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种巨噬细胞特异性USP13过表达的重组腺相关病毒及其在制备脊髓损伤治疗药物中的应用。

背景技术

脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)发病率高、致死致残率极高，常导致损伤节段以下肢体严重感觉及运动功能障碍。随着人口老年化水平迅速上升及交通运输业的飞速发展，SCI发病率逐年递增。日益增长的SCI不仅对患者身心造成严重伤害，同时也是家庭及整个社会的沉重负担。然而，到目前为止，仍没有有效的解决及治疗方法。

血脊髓屏障是由连续排列的脊髓血管内皮细胞通过细胞间紧密连接构成，正常情况下其可作为自然的生理屏障阻止外周的炎症细胞及因子的侵袭。然而，SCI后5分钟之内血脊髓屏障破裂，大量外周来源的巨噬细胞、炎症细胞通过破损的血管内皮细胞间隙进入中枢脊髓损伤中心，导致损伤灶附近严重的炎症级联反应、胶质细胞激活、神经元细胞死亡，最终加剧SCI发展。外周浸润的巨噬细胞及中枢来源的小胶质细胞在SCI后显著激活，根据其表面标志物的不同，可分为促炎M1型以及抑炎M2型。M1型巨噬细胞分泌炎症细胞因子和趋化因子，进而维持和加重炎症反应，增加神经细胞的兴奋性和毒性，导致神经元死亡。SCI约1周后，巨噬细胞开始向M2型极化，M2型巨噬细胞进行组织碎片的吞噬、细胞营养因子的释放、促进组织修复和抑制炎症反应，参与继发性SCI的修复过程。总之，SCI后的微环境变化是一个非常复杂的动态过程，目前已知的是，极化的巨噬细胞在此过程中扮演着非常重要的角色，因此，如何调控巨噬细胞的极化对于SCI的预后极为重要。

泛素化是常见的蛋白质翻译后修饰方式之一，其参与了体内包括胚胎发育、细胞分化与分裂、转录调控、炎症免疫反应、肿瘤发生发展等诸多生理以及病理过程。而在神经系统中，泛素化修饰也参与了神经系统发育、干细胞分化、神经轴突再生、胶质细胞激活等过程。泛素化修饰是一个可逆反应，而去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)主要通过将泛素分子从目标底物靶蛋白上切割下来从而介导这一过程。由于其独特的结构和功能的多样性，近年来，DUBs在诸多疾病模型中的作用不断被发现和报道。然而，其在脊髓损伤中的功能作用鲜有报道。

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)属于细小病毒科内的依赖细小病毒属，是用于治疗多种人类疾病的基因传递工具。开发理想的AAV衣壳、优化基因组设计和利用革命性生物技术方面的最新进展为临床上基因治疗领域的发展做出了重大贡献。AAV作为理想的治疗载体在基因置换、基因沉默和基因编辑方面广受欢迎，其中两种基于AAV的疗法已在欧洲或美国获得了监管部门的批准。由于有血脊髓屏障的存在，传统药物干预很难抵达中枢神经系统发挥相应的作用，而AAV却不受血脊髓屏障的限制，同时具有易获得、高安全性、低免疫原性、强靶向性，能够长期稳定表达外源基因等优点。

因此，通过构建一种重组腺相关病毒在脊髓损伤后靶向调控损伤灶内的巨噬细胞的IκBα蛋白泛素化水平，抑制下游NF-κB信号通路来促进巨噬细胞M2极化以改善脊髓损伤功能预后，具有重要的意义。

发明内容