[发明专利]一种无菌丰年虫的制作方法及其应用

说明书

本发明属于水产养殖技术领域，具体公开了一种无菌丰年虫的制作方法及其应用。本发明经过处理浓度、无菌和孵化效果对比及方法优化，最终获得5种快速、高效、简便、较为成熟的孵化方案，用于制备无菌丰年虫；制得无菌丰年虫可作为所有鱼类及其他水生生物模型的开口期至成年阶段的重要活体饲料。与传统方法相比，本方法均具有孵化装置简单、避免曝气污染、获得孵化后丰年虫时间短、无菌率高、成本低、易操作等特点，为长期无菌鱼类模型构建、无菌丰年虫模型的环境毒性检测等科研领域提供了重要的技术支撑。

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，特别是涉及一种无菌丰年虫的制作方法及其应用。

背景技术

丰年虫(Brine shrimp,Artemia salina),俗名丰年虾、盐水丰年虫、盐虾或鳃足虫，为节肢动物门、鳃足纲、无甲目、盐水丰年虫科，卤虫属(Artemia)，一种小型低等、广温、耐高盐型甲壳动物。丰年虫具有较强适应能力、繁殖能力，休眠卵可长时间保存且孵化时间短，孵化出的无节幼体含丰富蛋白质和不饱和脂肪酸，及类胡萝卜素、核黄素和一些蜕皮激素类物质，因其极高的营养价值而成为当前世界85％以上的水产动物育苗饵料。此外，丰年虫因其生活习性和特殊生理结构常被应用于环境污染物评价和生态毒理学研究中，属于标准实验生物，故无菌丰年虫模型的制备具有重要研究意义。

斑马鱼(Zebrafish,Danio rerio)模式生物具有生长周期短、产卵量多、胚胎透明、易饲养、与人类基因组高度相似等优势，通常用于环境毒理学、遗传发育学等研究。在2004年，Rawls et al.提出无菌斑马鱼模型建立方法，已被用于免疫、代谢、疾病模型、药物筛选等研究，但由于无菌动物微生物组的缺失、消化系统和免疫系统的缺陷，无菌鱼类模型及其应用研究受限制于早期卵黄供能无需进食阶段。开口期饵料是影响鱼类孵化初期至青少年时期存活率和生长率的最主要因素。多数鱼类从出膜到开口、从内源性营养转向外源性营养的过程伴随着消化系统的形成和逐渐完善。孵化幼鱼在开口摄食前已能分泌多种消化酶，但相对活性较差，不能有效利用饲料营养成分，而部分生物饵料可为幼鱼提供外源性消化酶，在一定程度上提高幼鱼的消化能力而促进其生长。常用的鱼类开口饲料有丰年虫、熟蛋黄、红线虫、微颗粒饲料等，但也有研究证明多数鱼类早期阶段对人工合成微颗粒不能真正消化吸收，并有肠道被逐渐填满死亡风险。天然饵料中，线虫体内富集大量有机磷、有机氯和重金属等毒害物质，且需要磨碎才能投喂早期幼鱼，极易污染养殖水体。相比而言，丰年虫喂食对幼鱼的生长速度和存活率都高于饲料组和熟蛋黄组，是最适宜的幼鱼开口饵料。另外，丰年虫也可作为其他模式鱼类如海水青鳉(Marine medaka,Oryziasmelastigma)、稀有鮈鲫(Rare gudgeon,Gobiocypris rarus)等开口期幼鱼至生长繁殖成鱼阶段的活饵饲料，丰富的营养成分对亲鱼性腺发育、产卵量和子代均有重要影响。

因此，无菌丰年虫(germ-free Artemia,GF-A)等开口活体饵料的制备是长期无菌鱼类模型建立的重要前提，尤其是相比微颗粒饲料和蛋黄处于静止状态和在水中容易失散而引起水质败坏的特征，丰年虫在养鱼水体能够存活一定时间，幼鱼与丰年虫活体相遇频率较高，比较适宜摄食。

目前丰年虫的孵化制作是采用曝气法，然而传统曝气法制作丰年虫时使用的孵化设备和操作过程复杂，孵化时间久，至少需要48h，且持续曝气极易导致污染。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种无菌丰年虫的制作方法及其应用，用于解决现有技术中传统曝气法制作丰年虫使用的孵化设备和操作过程复杂、孵化时间久、持续曝气极易导致污染等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种无菌丰年虫的制作方法，包括如下步骤：将丰年虫卵(Brine shrimp eggs)漂洗杀菌处理、灭菌水清洗干净后用筛网过滤，放入灭菌盐水中制成灭菌盐水虫卵混合液，然后进行无菌孵化，获得无菌丰年虫，无菌孵化方法选自以下方式中的任意一种：

(a)将灭菌盐水虫卵混合液置于封口膜封口的无菌瓶中，光照条件下在摇床上摇晃孵化；