[发明专利]一种羟苯磺酸钙中遗传毒性杂质的定量测定方法

说明书

本发明公开了一种羟苯磺酸钙中遗传毒性杂质的定量测定方法，本发明先采用酸性乙腈溶液配制衍生化试剂，既能保证羟苯磺酸钙、2‑磺酸基‑1,4‑苯醌、氢醌与1,4‑苯醌均能稳定存在，同时保证苯醌类杂质能与衍生化试剂反应完全，再采用乙腈水溶液充分溶解样品与杂质。针对衍生化后的样品溶液，以封端的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以pH4.5±0.5的缓冲溶液‑乙腈的混合溶液为流动相的高效液相色谱条件，实现对苯醌类杂质的分离与定量。本方法操作方便，对样品中苯醌类杂质检测专属性好，灵敏度高，精密度及重现性好，可准确的对羟苯磺酸钙中两个苯醌类杂质定量分析，保证了羟苯磺酸钙原料及制剂的安全性与质量可控性。

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及用柱前衍生化并采用高效液相色谱法分离测定羟苯磺酸钙中杂质的方法。

背景技术

羟苯磺酸钙作为长期用于临床的毛细血管保护药，自身结构式中含有对二酚羟基结构，很容易被氧化，一旦与水或空气中的氧气接触，很容易被氧化而产生2-磺酸基-1,4-苯醌杂质，即使样品放置于4℃温控进样器内，溶液中2-磺酸基-1,4-苯醌仍迅速增加，导致样品结果超出限度，且无法判定超限原因为样品本身不合格还是配制过程导致。该杂质具有遗传毒性结构，需要进行控制，且该杂质为新的化合物，国内外未有报道，为本公司合成部自制，具体制备过程如下：

在室温(20～25℃)、氮气保护、机械搅拌下将浓硫酸(29.4g)缓慢滴加入对苯二酚(20g)的环己烷(100g)溶液中，滴毕，加热至70～80℃反应0.5小时，冷却至室温，分离出环己烷，加入乙腈(200mL)溶解固体，溶清后，控制内温＜30℃下加入二氧化锰(80g)，室温下搅拌反应12小时。反应完毕，将反应液倾入冰无数乙醇中(400mL，2v/v)，过滤除去二氧化锰残渣，所得滤液再加入到冰水中(800mL，4v/v，以反应液体积计)，再采用0.45微米滤膜过滤，所得滤液冻干得到2-磺酸-1,4-苯醌黄色粉末状固体。采用核磁共振氢谱、高分辨质谱、电感耦合等离子测定确定了其化学结构，详细图谱参见图1～3。

另外，羟苯磺酸钙的起始物料氢醌，与羟苯磺酸钙结构相似，自身也易被氧化而产生1,4-苯醌，该组分也具有遗传毒性结构需要进行控制。经查询《The CarcinogenicPotency Database》数据库，1,4-苯醌的TD₅₀数据为5.07mg/Kg/d；根据ICH M7指导原则计算杂质限度，1,4-苯醌的TTC(毒理学控制阈值)为5.07μg/d，本品的日最大剂量为1.5g/d，因此制定1,4-苯醌限度均为3.38ppm；2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌结构相似，且均具有相同的警示结构，因此其限度也为3.38ppm。

因此，为保证药物的安全性，必须对上述两个杂质进行控制。但是2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌两个遗传毒性杂质，属于痕量组分，不易被检出；另外羟苯磺酸钙以及微量杂质氢醌，由于自身基团性质活泼，容易被氧化，而2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌具有较强的氧化性，因此四个组分在溶液中无法共存。

首先对于1,4-苯醌定量，由于1,4-苯醌与羟苯磺酸钙在溶液状态下发生氧化还原反应无法共存，将原料供试品溶液中定量加入1,4-苯醌后，系统适用性溶液中1,4-苯醌未出峰，而2-磺酸基-1,4-苯醌与氢醌则明显增加(如图4所示)，可见1,4-苯醌在溶液状态下与羟苯磺酸钙迅速完全反应生成2-磺酸基-1,4-苯醌与氢醌，因此不仅无法对1,4-苯醌的定量，同时还干扰2-磺酸基-1,4-苯醌的定量。

另外对于2-磺酸基-1,4-苯醌定量，由于1,4-苯醌的存在，羟苯磺酸钙溶液中测得的2-磺酸基-1,4-苯醌，无法明确该组分来源为羟苯磺酸钙本身还是溶液配制过程中的反应产物。同时羟苯磺酸钙溶液配制成溶液后，2-磺酸基-1,4-苯醌会不断增加，继续放置，该杂质仍会增加，表明溶液状态下主成分羟苯磺酸钙不稳定，会被不断氧化产生2-磺酸基-1,4-苯醌，进一步增加了该杂质定量的难度。