[发明专利]一种线粒体未折叠蛋白反应体系的建立方法

说明书

本发明公开了一种线粒体未折叠蛋白反应体系的建立方法。所述的方法包括以下步骤：1)根据G‑TPP分子式，合成高纯度TRAP1抑制剂G‑TPP；2)将步骤1)中所述的G‑TPP在DMSO中稀释成10mmol/ml的储存液；3)用含10vol％血清的培养基培养人源化细胞，待细胞铺满90％以上，添加步骤2)中的G‑TPP储存液，使其终浓度为10μmol/ml，处理2‑6h。该方法利用TRAP1特异抑制剂G‑TPP处理人源细胞系，其能干扰线粒体蛋白的正确折叠，能快速诱导UPR^MT，但不会激活UPR^ER，这为进一步研究UPR^MT的分子机制和UPR^MT在人类疾病和病毒感染中的作用提供了技术手段。

技术领域

本发明涉及一种线粒体未折叠蛋白反应体系的建立方法。本发明属于细胞应激体系构建技术领域。

背景技术

各种应激因素会造成未折叠或错误折叠蛋白在线粒体中的集聚超过其折叠能力，从而将信号传递到细胞核和细胞质，引起一系列基因的表达以恢复线粒体的正常功能，将这一过程称为线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response,UPR^MT)。

近年来关于UPR^MT的研究越来越多，研究表明，UPR^MT与阿尔茨海默病等神经退行性疾病、衰老、天然免疫和肿瘤的发生等密切相关，但是，目前关于UPR^MT机制的研究主要集中在秀丽隐杆线虫中，而哺乳动物的UPR^MT更为复杂，但研究很少，这严重制约了哺乳动物UPR^MT分子机制和UPR^MT分子机制在人类疾病和病毒感染中作用的深入研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、特异诱导线粒体未折叠蛋白反应体系的建立方法。本发明使用UPR^MT新型诱导剂Gamitrinib-TPP(G-TPP)，其是线粒体热休克蛋白90(heatshock protein,HSP90)家族TRAP1(TNF receptor-associated protein-1,TRAP1)的特异抑制剂，能干扰线粒体蛋白的正确折叠。在线粒体呼吸作用良好的人源细胞系上处理后，能快速检测到UPR^MT相关转录分子和分子伴侣在转录水平的表达，这为深入研究UPR^MT分子机制以及UPR^MT分子机制在人类疾病和病毒感染中作用提供支持。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明一种线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfoldedproteinresponse,UPR^MT)体系的建立方法，其包括用Gamitrinib-TPP(G-TPP)处理人源细胞系的步骤。

其中，优选的，所述的方法包括以下步骤：

1)根据G-TPP分子式，合成高纯度TRAP1抑制剂G-TPP；

2)将步骤1)中所述的G-TPP在DMSO中稀释成10mmol/ml的储存液；

3)用含10vol％血清的培养基培养人源化细胞，待细胞铺满90％以上，添加步骤2)中的G-TPP储存液，使其终浓度为10μmol/ml，处理2-6h。

其中，优选的，步骤3)中的处理时间为4h。

其中，优选的，还包括对UPR^MT相关转录分子和分子伴侣的表达水平进行检测的步骤。

其中，优选的，所述的检测是指采用qRT-PCR的方法对UPR^MT相关转录分子和分子伴侣的表达水平进行检测。