[发明专利]一种调控/降低乙酰辅酶A支路代谢高效合成7-脱氢胆固醇的方法

权利要求书

1.一种调控/降低乙酰辅酶A支路代谢高效合成7-脱氢胆固醇的方法，其特征在于，包括利用一类有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因，在工程菌内进行基因重组，以降低乙酰辅酶A分解；从而增强7-脱氢胆固醇合成；所述的在7-DHC合成中的一类有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因包括：

核苷酸序列如SEQ ID No.41所述的编码天冬氨酸转氨酶的aat1基因、核苷酸序列如SEQ ID No.42所述的磷酸甘油酸途径的磷酸丝氨酸磷酸酶ser2基因、核苷酸序列如SEQ IDNo.44所述的NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh1基因、核苷酸序列如SEQ ID No.43所述的NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh3基因、核苷酸序列如SEQ ID No.45所述的CDP-二酰基甘油-丝氨酸O-磷脂酰转移酶cho1基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因的方法是敲除这些基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法不仅包括利用上文所述的一类有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因，还包括利用增加乙酰辅酶A合成的基因，在工程菌内进行基因重组。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的增加乙酰辅酶A合成的基因包括：核苷酸序列如SEQ ID No.40所述的线粒体苹果酸脱氢酶mae1基因、乙醇脱氢酶II adh2基因或D-乳酸脱氢酶dld1基因。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用有关乙酰辅酶A合成的关键基因的方法是对增加乙酰辅酶A合成的基因进行增强表达；所述的增强表达的途径包括使用下述组成型启动子：P_TDH3、P_TEF1、P_PGK1、P_ENO2、P_TPL1，或者使用下述诱导型启动子P_GAL1、P_GAL10、P_GAL7。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的工程菌选自酿酒酵母S288C、酿酒酵母BY4742、酿酒酵母Y187、毕赤酵母x-33或热带假丝酵母1798。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过过表达和敲除相关基因，控制酵母中整体的辅因子NADH/NAD+的比例范围是0.3-0.8。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以原始酿酒酵母S288C为出发菌株，导入7-DHC合成模块，同时使用启动子P_TDH3控制核苷酸序列如SEQ ID No.40所述的线粒体苹果酸脱氢酶mae1的表达，接下来使用Cas9分别对核苷酸序列如SEQ ID No.41所述的编码天冬氨酸转氨酶的aat1、核苷酸序列如SEQ ID No.44所述的NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh1、核苷酸序列如SEQ ID No.43所述的NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh3和核苷酸序列如SEQ IDNo.45所述的CDP-二酰基甘油-丝氨酸O-磷脂酰转移酶cho1基因进行敲除。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的7-DHC合成模块是包括核苷酸序列如SEQ ID No.46所述的经密码子优化的来源于鸡的DHCR24还原酶基因，内源C-8甾醇异构酶ERG2，内源C-5甾醇去饱和酶ERG3。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以原始的酿酒酵母S288C为出发菌株，使用启动子P_TDH3控制核苷酸序列如SEQ ID No.40所述的线粒体苹果酸脱氢酶mae1的表达，接下来使用Cas9分别对核苷酸序列如SEQ ID No.41所述的编码天冬氨酸转氨酶的aat1、核苷酸序列如SEQ ID No.44所述的NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh1、核苷酸序列如SEQ IDNo.43所述的gdh3和核苷酸序列如SEQ ID No.45所述的CDP-二酰基甘油-丝氨酸O-磷脂酰转移酶cho1基因进行敲除。