[发明专利]一种调控/降低乙酰辅酶A支路代谢高效合成7-脱氢胆固醇的方法

说明书

本发明公开了一种调控/降低乙酰辅酶A支路代谢高效合成7‑脱氢胆固醇的方法，其利用一类有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因降低乙酰辅酶A分解，同时平衡细胞内还原力，进而高效合成7‑脱氢胆固醇的方法。该方法克服了传统的只通过增强乙酰辅酶A用于提升7‑脱氢胆固醇的技术，而是提供有关7‑脱氢胆固醇合成相关的基因，并通过对这些基因的过表达和敲除，进而增强乙酰辅酶A的合成，同时降低乙酰辅酶A消耗，实施例证明其最终7‑DHC的产量达到269mg/L；比SC001的7‑DHC产量提高了25倍；达到增强7‑脱氢胆固醇在微生物中合成的目的。

技术领域

本发明涉及一种，特别涉及一种调控/降低乙酰辅酶A支路代谢高效合成7-脱氢胆固醇的方法。

背景技术

维生素D₃(Cholecalciferol,VD₃)是一种人体必需的脂溶性维生素，调节人体中的钙、磷代谢，因此，常作为于治疗佝偻病、软骨病和维持钙稳态等方面的药物。一般成年健康的人类可以通过将体内摄入的胆固醇转化为VD₃，而不需要额外补充VD₃。但是随着全球老龄化人口的增加，老年人户外活动减少，并且随着年纪的增长，人体吸收能力的降低和内脏功能的退化，便会出现因VD₃缺乏而导致的骨质疏松等疾病。不光是老年人需要补充VD₃，婴幼儿由于刚出生吸收能力还未完全成熟，并急需供应身体快速生长所需要的营养物质，因此，同样需要额外补充VD₃。7-脱氢胆固醇(7-dehydrocholestero，7-DHC)是合成VD₃的重要前体物质，它经过紫外照射转化为VD₃。7-DHC是一种重要的甾体激素类药物中间体，不光能合成VD3，同时也是合成雄甾烯二酮(4AD)等甾体药物的中间体。为了满足全球VD₃的巨大市场，工业上将获得的7-DHC，在230-300nm的高压汞灯照射下转化为VD₃，因此，生产VD3的核心问题在于7-DHC的合成。

传统的工业化7-DHC的制备方法主要有提取法(鱼肝油为原料)和化学合成法，因容易受到过敏反应的影响，提取法目前已逐步被化学合成法所替代。化学合成法是以羊毛脂胆固醇为原料，经过氧化、溴化、消除和水解反应合成7-DHC。化学合成法中底物羊毛脂胆固醇的质量直接决定了最终产物7-DHC的质量，因此，为了获得高品质的羊毛脂胆固醇，通常也需要进行酸化等处理。化学合成的方法虽然是目前工业化生产中常用的方法，但是其能耗高，反应条件苛刻且后处理繁琐，并对环境污染严重。利用微生物发酵法生产7-DHC具有绿色可持续的优势，并且微生物(如酿酒酵母)是一种安全可靠，具有巨大工业化应用潜力的微生物，是生产7-DHC和VD₃优秀的底盘细胞。

7-DHC的微生物合成主要集中在已知合成路径中基因的增强和分支路径的阻断，但所需强化的基因同样也适合生产其他产物。利用微生物进行7-DHC的生产时，强化和阻断的基因虽然对合成目标产物具有一定的效果，但是由于7-DHC的合成涉及多个合成路径，往往会造成代谢通量失衡，给生产菌株带来负面影响。VD₃的微生物合成主要集中于菌株的筛选方面，但是菌株的筛选费时费力，不仅要确定高效的筛选方法，还需要花费大量金钱进行大规模后期筛选与发酵检测，才能获得VD₃产量极低的菌株。如中国专利CN103275997A、美国专利US2007/0204059A1、中国专利CN107075551B、中国专利CN104988168A。