[发明专利]胰岛细胞及其分离方法

说明书

本发明提供了一种胰岛细胞及其分离方法，该分离方法包括：将离体的胰腺组织放入磷酸缓冲盐溶液中，将胶原酶溶液多部位灌注处理过的胰腺组织内，使其充分膨胀，得到肿胀的胰腺组织；将肿胀的胰腺组织放入含胶原酶溶液中，离心，消化数次，加入缓冲液终止消化，离心，弃上清，重悬，得到重悬液；过滤，滤液经过数次重悬，得到糜状消化终产物，过滤，得到沉淀物，吹至培养皿中，收集即可；本发明在进行胶原酶胰腺灌注时，采用多部位缓慢注射，从而能充分充盈胰腺组织，减少操作时间，且操作简便，成功率高，也避免了以往切碎法胶原酶溶液难以到达组织块的内部，组织内外消化速度不一致导致的胰岛损伤，能满足体外基础实验的要求。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种胰岛细胞及其分离方法。

背景技术

糖尿病是由多种原因引起的胰岛β细胞功能减退或衰竭，导致胰岛素绝对或相对不足。胰岛移植是一种治疗胰岛素依赖型糖尿病的新型手段，而胰岛的体外分离、纯化培养是有效治疗的前提和关键。对于人胰岛分离的2个关键步骤是胰岛灌注和胰岛分离，胶原酶灌注是保证胰岛分离质量和数量的关键步骤。传统的组织剪碎消化法最早在1965年首创，但组织切碎消化法胶原酶溶液很难到达组织块的内部，会造成组织内外消化速度不一致，导致胰岛的活力较差，且极易损伤胰岛，随后被改良。胰腺组织剪碎消化法及机械研磨法收集胰岛细胞，虽然简单易行，但获得胰岛细胞数量及质量急需改进，随后研究者建立了胆总管灌注胶原酶消化胰腺，胆总管穿刺需要操作者有足够的经验，并要求胆总管有足够的长度。用Ficoll密度梯度离心法分离纯化小鼠胰岛。V型胶原酶消化联合密度梯度离心法分离小鼠胰岛细胞，获得胰岛细胞的产量、纯度及功能均很低。目前，更多的研究者使用胶原酶P，其具有更好的消化效果。

通过供体的胰腺分离从而获得高质量的活体细胞，然而，目前的胰岛分离制备技术，得到胰岛的产量、活率和纯度均较低。影响胰岛分离结果的因素包括：供者的年龄，冷缺血时间，胰腺的大小及重量，胰腺本身是否病变以及胰腺切取的完整性，胰腺的保存和消化时间的掌握等。胰岛消化、终止过程全凭文献研究所得适当时间间隔及以往实验经验。现有分离胰岛的技术主要应用机械分离法，持续应用机械力量和消化液流动的冲击力来冲击胰腺达到消化的目的。这种分离方法快速彻底，但是分离后的胰岛容易破碎，不适宜人的胰岛分离。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种胰岛细胞及其分离方法，主要用于胰岛细胞功能及糖尿病病理生理的分子机制研究，实现小规模小成本胰岛细胞分离，为将来降低胰岛移植的成本奠定基础。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

目的之一，本发明提供了一种胰岛细胞的分离方法，该方法为非疾病的诊断和治疗目的的方法，其包括如下步骤：

(1)、将离体的胰腺组织放入磷酸缓冲盐溶液中，除去外周附着脂肪组织、血管等，得到处理过的胰腺组织；

(2)、将胶原酶溶液通过注射器针头多部位灌注步骤(1)中处理过的胰腺组织内，使其充分膨胀，得到肿胀的胰腺组织；

(3)、将肿胀的胰腺组织放入含胶原酶溶液的离心管中，置于37℃水浴振荡消化数次，消化结束后手动振荡离心管，再于37℃水浴振荡消化，消化的时间为8-10min，加入G-solution缓冲液终止消化，得到消化液；

(4)、将消化液离心，弃上清，加入G-solution缓冲液重悬，得到重悬液；

(5)、用G-solution缓冲液提前预湿不锈钢筛，将重悬液用预湿的不锈钢筛过滤，得到滤液；

(6)、滤液经过数次重悬，得到糜状消化终产物，通过细胞滤器过滤，得到沉淀物；

(7)、将细胞滤器倒置于一个新的培养皿中，用移液器吸取配好的细胞培养基，通过移液枪将细胞滤器中的沉淀物吹至培养皿中，显微镜下观察，手工挑选收集胰岛细胞。