[发明专利]一种以RBD靶向递送shRNA的nCOVsiRNA药物制备方法

说明书

本发明涉及一种以RBD靶向递送shRNA的nCOVsiRNA药物制备方法，发现源自冠状病毒受体结合域的新型靶向递送载体RBD和源自冠状病毒保守基因的抗变异毒株靶标shRNA。合成shRNA和RBD，并使shRNA正反义链分别连接RBD的N端，构成以RBD靶向递送shRNA的具有基因药物和大分子疫苗双重作用的化合物，并使RBD和shRNA相互增效产生诸多新功能。其中shRNA既是广谱抗病毒药物又是使RBD疫苗增效的免疫佐剂；RBD既作为靶向递送载体从而可避免非靶向基因治疗的副作用，又是常用的蛋白疫苗，其免疫产生的抗‑RBD能中和病毒、阻止病毒通过ACE2感染，双份RBD与shRNA合成的化合物增加了分子量及结构复杂性从而增强抗原性，被RBD结合的shRNA不易被酶降解、易通过细胞膜、易被递送到靶细胞浆。

技术领域

本发明涉及一种以RBD靶向递送shRNA的nCOVsiRNA药物制备方法，属于传染病防治的生物制药领域。

背景技术

新型冠状病毒的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)，其中S蛋白的N端由结构域(S1-NTD)和受体结合域(S1-RBD)组成，新型冠状病毒通过其受体结合域S1-RBD与宿主细胞受体ACE2结合引起感染。

ACE2为I型跨膜糖蛋白，由805个氨基酸组成，包括跨膜区、胞内羧基端和胞外氨基端，冠状病毒通过其S1-RBD与ACE2的细胞外催化结构域互动结合，导致细胞内吞、膜融合，使病毒进入表达ACE2或含有ACE2受体的细胞。

因新冠病毒通过其RBD与ACE2结合引起感染，所以现有疫苗基本针对RBD进行研发，已有多款疫苗用于临床，世界各国也尝试了如瑞德西韦、洛西那韦、利托那韦、氯喹、羟氯喹、激素、干扰素等药物，虽然取得了某些效果，但特别是针对变异毒株目前仍缺少特效药。

RNA干扰(RNAi)作为一种高效的序列特异性基因沉默技术，正在给疾病的治疗带来难以想象的应用前景，已有多种siRNA药物被FDA审批上市。小干扰RNA(siRNA)大约21～23bp，以参与RNA干扰(RNAi)的方式调节基因表达,特异性降解与之互补的靶信使RNA(mRNA)，但无论是细胞水平还是活体内，使用siRNA进行基因干扰均要克服很多困难：1)膜通透性：siRNA带有大量的负电荷，分子量大(～13KD)，自身很难穿过细胞膜，运输siRNA主要靠化学修饰和一些运输载体；2)抗核酸酶降解：siRNA由大量的核糖核酸分子构成，很容易被外界的RNA酶降解，如果在设计siRNA及选择运输载体时不对碱基进行特定的化学修饰或采取载体保护方法，则在siRNA进入作用位点前即被RNA酶降解；3)靶向递送及载体：siRNA的作用位点主要在靶细胞浆内，所以需将siRNA特异性递送给靶细胞浆，如果不能有效地选用合适的靶向递送载体并及时使siRNA从内涵体释放到胞浆，通常可激活细胞免疫反应，导致干扰素等细胞因子的释放，所以，如何有效地将siRNA运输并释放到靶细胞浆是影响RNAi效果的瓶颈问题，有些siRNA能导致序列或浓度依赖性非特异性基因沉默即脱靶，因此，在设计siRNA时，应同时考虑靶向递送、基因抑制效果以及尽可能选择低脱靶效应的序列。

在COVID-19的防治中，如果能以合适的靶向递送载体将nCoVsiRNA稳定地、特异地依次递送给靶器官、靶组织、靶细胞、定位于靶细胞、穿越靶细胞膜、释放到靶细胞浆，并对多种变异毒株广谱有效，就应能更好地开展COVID-19的靶向基因治疗。

所以，本发明要设计、合成以RBD靶向递送shRNA的nCOVsiRNA药物制备方法。

发明内容

本发明的目的是要提供一种以RBD靶向递送shRNA的nCOVsiRNA药物及其合成和用途；在nCOVsiRNA药物中，shRNA具有靶向基因治疗和免疫佐剂的双重作用，RBD具有靶向递送和蛋白疫苗的双重作用，脂质体具有稳定shRNA、细胞转染和免疫佐剂的作用。

本发明的目的通过以下技术方案实施：