[发明专利]一种用于检疫鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子粉基体标准样品制备方法

说明书

本发明属于植物检疫鉴定领域，公开了一种用于检疫鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子粉基体标准样品制备方法，先后经过种子批中感染的CGMMV野生株鉴定、确定原料重量、低温研磨、筛分处理、搅拌混匀、分装储存及性能评价、溯源性描述及联合定值，得到的CGMMV种子粉基体标准样品的均匀性、稳定性及不确定度适中，在一定的时间内CGMMV特性量值不会随着时间的变化而产生变化，样品的均匀性和稳定性符合国家标准样品的要求，填补了我国目前没有该类种子粉基体标准样品的空白，可以用于种子及制品中CGMMV检疫鉴定方法验证、检测试剂盒评价、实验室检测过程质量控制、实验室能力验证和比对、人员能力考核，提高植物检疫鉴定实验室的检疫检测水平。

技术领域

本发明属于植物检疫鉴定领域，本发明涉及一种用于植物检疫鉴定实验室质量控制的黄瓜绿斑驳花叶病毒种子粉基体标准样品制备方法，具体为一种植物检疫鉴定限制的用于检测种子及其制品植物病害的黄瓜绿斑驳花叶病毒种子粉基体标准样品的制备方法。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒病(CGMMV)是一种毁灭性的植物病害，主要危害黄瓜、西葫芦、西瓜和甜瓜等瓜类作物，导致叶片呈现斑驳、果实变形和植株发育迟缓，产量显著下降，严重威胁着瓜类作物的生产。2003年我国首次在广西观赏南瓜上发现该病毒，近几年又陆续在广东、湖南、江苏、海南、辽宁等地发现。该病毒已被许多国家和地区列为重点关注的检疫性有害生物。CGMMV的主要传播途径是种子传播以及植物花粉。瓜类作物是世界上最重要的食用植物之一，也是最重要的园艺植物之一，更是农民增收的重要产业。从CGMMV传播状况来看，实施作物田间监测，极早发现、及时阻断感染源，对于瓜类作物的健康培育极其重要。

CGMMV是瓜类种子检疫鉴定最常见的检测项目。按照我国现有执行的GB/T36781-2018《瓜类种传病毒检疫鉴定方法》，采用ELISA方法检测蛋白、RT-PCR方法检测核酸进行CGMMV检疫鉴定。在检疫鉴定中需要使用CGMMV标准样品。标准样品是一批确定具有足够均匀、足够稳定的特性值的物质，为确保该批样品在不同空间中进行量值传递，该批标准样品提供的量值必须是均匀一致的。标准样品作为检测行业中的“量具”，在校准测量仪器和装置、评价分析方法、检测特性值和考核分析人员的操作技术水平，以及在实验室检测过程中的质量控制等领域起着不可或缺的作用。目前国内外尚没有CGMMV种子粉基体标准样品，由于CGMMV寄生在种子等植物上，健康种子不携带CGMMV，而被感染的每粒种子则带毒量不同，CGMMV分布不均匀，导致不同的样品会在不同实验室、不同人员等方面造成极大的检测误差。以上原因使得制备难度很大导致国内外目前还缺乏用于检疫鉴定量值保障的CGMMV种子粉基体标准样品，对我国瓜类作物中CGMMV的检疫鉴定带来了不便。

现有技术中存在检测葫芦科种子携带CGMMV的样品制备方法，比如有CN105177187A专利申请公开了“检测葫芦科种子携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品制备方法及用途”，涉及一种携带CGMMV的葫芦科种子样品的处理，以及血清学和分子生物学检测方法及应用。包括以下步骤：种子样品种仁和种壳的分离，剥除种仁部分，收集剩余的种壳；样品的研磨是以1粒种子分离的种壳作为1个样品放入离心管中，经液氮冷冻1分钟后，然后放入全自动样品快速研磨仪中研磨，制备了该1粒种子种壳的粉末状样品。然而，该方法针对1粒种子的种壳进行粉碎，仅适用于对该粒种子进行检疫鉴定。每粒种子的带毒量不同，以1粒种子的种壳来制备粉末状样品，对于无法保证每粒种子都携带CGMMV的样品而言，这种制备方法既费时费力，又无法保障大批量种子中CGMMV的分布均匀性，不适合用于制备大批量的标准样品。此外，更为重要的是，上述产品目标不是提供用于各类实验室检疫鉴定质量控制用的标准样品，且仅1粒种子种壳的粉末状样品，无法开展大批量标准样品中特性量值的均匀性和稳定性评价，不符合国家标准样品的制备要求，因此，还需要开发用于检疫鉴定种子及其制品植物病害的CGMMV种子粉基体标准样品的制备方法。

发明内容