[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物，其特征在于：所述检测引物如下所示：

上游引物PEDV-F：TTGCTAGGCTCGCARGTAC，其为SEQ ID NO.1序列；

下游引物PEDV-R：CGGACGACRAATGCGTGGGT，其为SEQ ID NO.2序列。

2.一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的检测引物和TaqMan荧光探针；所述特异性TaqMan荧光探针如下所示：

荧光探针PEDV-P：FAM-TCTGGCCCTGCCCACCACGT-BHQ1，其为SEQ ID NO.3序列，FAM为荧光报告基因，BHQ1为荧光淬灭基因。

3.如权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒反应体系中上下游引物浓度为0.1-1μm，荧光探针浓度为0.1-1μm。

4.一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测方法，其特征在于：利用上述权利要求2至3任一所述的试剂盒进行猪流行性腹泻病毒检测。

5.如权利要求4所述的一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)反应体系配制：取出PEDV Mix、One Step-RT-qPCR酶、阳性对照和阴性对照，置于室温下完全融解，充分颠倒混匀后短暂离心；按照PEDV Mix和酶系以(11.5×n)μL+(1×n)μL＝(12.5×n)μL的比例计算所需配制反应数，充分混匀，配制成PCR反应液；其中，PEDV Mix包括上下游引物、荧光探针、buffer和过滤水；

(2)根据检测样品的数量向每个PCR反应管中加入12.5μL PCR反应液，然后取12.5μL的阴性对照、待检样品RNA、阳性对照分别加入到不同的PCR反应管中，盖紧管盖，将PCR反应管瞬时离心；

(3)荧光PCR操作：将瞬时离心好的PCR管放入荧光PCR检测仪内，采用一步法使逆转录和扩增在同一管中进行，按照如下反应设置：第一阶段，50℃逆转录15min；第二阶段，95℃预变性2.5-3min；第三阶段，93-95℃变性10s，55-60℃延伸30s，共40-45个循环；荧光收集在第二阶段每次循环的55-60℃延伸时进行，选择FAM荧光检测通道，收集FAM荧光信号；

(4)结果判定：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，同时观察报告基团FAM有无扩增曲线出现。

6.如权利要求2所述的的试剂盒在制备猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测的TaqMan实时荧光PCR试剂中的用途。