[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物、试剂盒及应用

说明书

本发明公开一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物，所述检测引物如下所示：上游引物PEDV‑F：TTGCTAGGCTCGCARGTAC，其为SEQID NO.1序列；下游引物PEDV‑R：CGGACGACRAATGCGTGGGT，其为SEQ IDNO.2序列；同时其用TaqMan探针荧光定量检测法，建立了针对猪流行性腹泻病毒M基因的检测方法，可以有效区分野毒感染该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，为猪流行性腹泻的鉴别诊断提供了良好的技术支持。

技术领域

本发明属于病毒分子生物学，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物、试剂盒及应用。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(PEDV)会引起猪接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和脱水为特征，可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率越高。哺乳猪、架子猪或肥育猪的发病率很高，尤以哺乳猪受害最为严重，母猪发病率变动很大，约为15-90％。猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV)系冠状病毒科冠状病毒属成员，属于Ⅰ类冠状病毒，α冠状病毒属，猪流行性腹泻病毒(PEDV)经口鼻感染后直接进入小肠，在小肠上皮细胞增殖，引起小肠绒毛吸收上皮细胞病变、损伤、脱落和小肠绒毛萎缩，导致肠内酶活性降低，吸收功能障碍，肠道内渗透压增高，引发渗透性腹泻，最终造成掉膘、降低饲料吸收利用率，导致猪的死亡，是影响全球养猪业的最重要病毒之一。

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长28kb，有七个开放阅读框，编码4个结构蛋白(纤突蛋白(S)、小膜蛋白(sM)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N))和3个非结构蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3)。现有技术中常常由于N蛋白能够参与病毒基因组的转录，能与细胞膜和磷脂结合，促进病毒核心的形成以及病毒RNA的组装，进而利用N蛋白来建立针对PEDV分子生物学诊断技术。专利号为CN103866050A的中国专利公开了“猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法及其引物”，其中，具体公开了根据猪流行性腹泻病毒的N基因序列设计引物，通过对荧光定量反应条件的优化，使其具有较好的特异性和重复性，用于PEDV的快速检测。

荧光PCR技术已经广泛应用在各种猪病的诊断中，技术成熟，Taqman探针法荧光PCR技术与染料法荧光PCR相比多了一条探针，特异性更好，应用广泛，通过对不同探针标记不同的发光基团可实现病原多重检测，与传统PCR检测比，检测速度快，敏感性高，不需要开盖电泳检测PCR产物，减少实验室气溶胶污染风险。

PEDV的M蛋白作为一个膜糖蛋白，在PEDV病毒的遗传进化过程中很少发生突变，从而保证宿主识别的一致性，因此M基因具有高度的保守性。本申请通过PEDV不同毒株M基因的序列比对，选取了M基因的中段保守序列设计引物及探针，能够实现最大限度识别PEDV的所有毒株。

发明内容

本发明目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物及应用，其中采用TaqMan探针荧光定量检测法，建立了针对猪流行性腹泻病毒M基因的检测方法，可以有效区分野毒感染该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，为猪流行性腹泻的鉴别诊断提供了良好的技术支持。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物，所述检测引物如下所示：

上游引物PEDV-F：TTGCTAGGCTCGCARGTAC，其为SEQ ID NO.1序列；

下游引物PEDV-R：CGGACGACRAATGCGTGGGT，其为SEQ ID NO.2序列。

本发明还提供一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测试剂盒，包括扩增引物和TaqMan荧光探针；所述扩增引物和特异性TaqMan荧光探针如下所示：

上游引物PEDV-F：TTGCTAGGCTCGCARGTAC，其为SEQ ID NO.1序列；