[发明专利]含CpG ODN的吸附型疫苗的解吸附组合物及其应用

说明书

本发明提供了一种含CpG ODN的吸附型疫苗的解吸附组合物，其中，所述解吸附组合物包括磷酸钾盐、M199培养基、氯化镁、Triton‑100。另一方面，本发明提供一种用于含CpG ODN佐剂的吸附型疫苗的试剂盒，包含上述解吸附组合物。另一方面，本发明提供一种体外检测含CpG ODN佐剂的吸附型疫苗效力的方法。另一方面，本发明提供所述的组合物、试剂盒、检测方法，在含CpG ODN佐剂的吸附型疫苗的解吸附及体外效力检测中的应用。本发明提供的解吸附组合物填充了含CpG ODN佐剂的吸附型疫苗抗原解离方面的空白，提供了快速准确的含CpG ODN佐剂的吸附型疫苗效力测定方法，具有开拓性意义。

技术领域

本发明涉及含佐剂疫苗效力的测定，具体是关于一种含CpG ODN的吸附型疫苗中的解吸附组合物及含CpG ODN的吸附型疫苗中抗原效力测定方法。

背景技术

佐剂是多种人用疫苗的重要成分，疫苗中加入佐剂可以增强机体对抗原的免疫应答。铝佐剂是开发最早、应用最广的疫苗佐剂。铝佐剂对抗原的吸附受其自身理化性质、溶液的离子强度和抗原的浓度等多种因素影响，其通过抗原储库效应、刺激树突状细胞成熟和T细胞分化、促进危险信号分子释放等来增强免疫应答。

CpG ODN（CpG oligonucleotide）在新型佐剂中较有代表性，能与细胞膜上的Toll样受体结合，诱导多种细胞因子产生。CpG ODN与TLR9结合后，通过MYD88、IRAK和TRAF6最终激活多种转录因子，包括NF-κB、AP1、CEBP和CREB。这些转录因子直接上调细胞因子和趋化因子基因表达。CpG ODN通过激活这些细胞启动免疫刺激，最终导致自然杀伤细胞（NK）间接成熟、分化和增殖的级联反应，T细胞和单核细胞/巨噬细胞一起分泌细胞因子和趋化因子，产生促炎症因子（IL-1、IL-6、IL-18及TNF）和Th1偏向性免疫（IFNγ、IL-12）CpG ODN具有稳定、低成本、易合成、高效低毒等优点，具有诱导Th1免疫反应的偏好性，并可延长产生抗体的持久性，是疫苗研究中应用广泛的佐剂。

CpG ODN与其他佐剂联用可发挥更高的生物利用率，使用情况主要包括CpG ODN单佐剂、CpG ODN佐剂加氢氧化铝或MF59佐剂等。由纳米铝佐剂、CpG ODN佐剂及其他相关辅料组成的CpG ODN复合佐剂，改善抗原递呈细胞的抗原摄取，激活抗原递呈细胞的功能性成熟，产生细胞因子和趋化因子从而增加抗原的免疫原性。

酶联免疫法目前仍是最简单有效的抗原检测方法之一。但抗原与CPG ODN佐剂复合物之间存在的相互作用力，形成的佐剂-抗原吸附物沉淀，无法直接使用酶联免疫法检测其含量。

CPG ODN佐剂复合物吸附抗原的主要机制是静电吸引、疏水作用等力，部分金属离子螯合剂、表面活性剂等物质，可以针对性破坏抗原与佐剂之间的相互作用力，从而使抗原解离下来。但是，几乎所有解吸附剂都会或多或少的对蛋白质的结构造成破坏，引起蛋白质变性，导致其结构被破坏，从而无法进行检测。目前，现有的解吸附配方均未能对CpG ODN复合佐剂吸附型疫苗具有良好的解吸附作用。

对此，开发一种用于定量检测CpG ODN复合佐剂吸附型疫苗有效成分的解吸附方法，使其形成稳定的溶液体系，重新暴露出抗原表面上相应的抗原决定簇，同时不影响抗原表位的结构特异性，对实现疫苗中抗原的准确定量检测至关重要。目前，国内外尚无针对CpG ODN复合佐剂吸附型疫苗有效成分解离方法的相关报道。

CN111812313A铝佐剂吸附型新型冠状病毒灭火疫苗中抗原的解离方法，采用的解吸附组合物包括蔗糖、氯化镁、磷酸钾盐和聚山梨酯-80；蔗糖、氯化镁、磷酸钾盐和聚山梨酯-80的用量比为（50-100）g：（2-6）g：（0.3-0.6）mol：（0.5-1）ml。铝佐剂吸附型新型冠状病毒灭活疫苗中抗原的解离方法在CpG ODN复合佐剂吸附型疫苗不适用，只能用于单佐剂即铝佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的解吸附。此解吸附过程需要超声，超声对CpG ODN复合佐剂吸附疫苗的抗原结构特异性会造成破坏。