[发明专利]一种敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系及其构建方法

权利要求书

1.一种敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、靶点选择及sgRNA的设计和合成；

S2、构建pLentiCRISPR-Mx-sgRNA载体；

S3、嘌呤霉素筛选阳性克隆；

S4、慢病毒处理及T7E1酶切检测；

S5、单克隆细胞株筛选。

2.如权利要求1所述的敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3及sgRNA4，其序列分别为：

sgRNA1：GTGATTGGAGACCGGAACTC；

sgRNA2：TACTTGCTCCCTACAAGGAG；

sgRNA3：GCGTTTACTTGCTCCCTACA；

sgRNA4：AAAGTCTACCAGGTATTGGT。

3.如权利要求1所述的敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中，包括如下步骤：

A、酶切pLentiCRISPR v2骨架载体；

B、回收酶切后的线性化pLentiCRISPR v2骨架载体，将其与退火后的sgRNA双链进行连接。

4.如权利要求3所述的敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系的构建方法，其特征在于：利用BsmBⅠ酶对pLentiCRISPR v2骨架载体进行酶切。

5.如权利要求3所述的敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤B中，连接体系包括：5μL Ligation solution A、1μL双链sgRNA、2μL线性化pLentiCRISPR v2载体、1μL Ligation solution C。

6.如权利要求5所述的敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系的构建方法，其特征在于：所述连接体系用ddH2O补至10μL。

7.如权利要求3所述的敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤B中，连接程序为：过夜连接，随后将连接产物转化至DH5α感受态细胞，将连接产物加入100μLDH5α感受态细胞中，冰浴30min后，水浴锅42℃热激90s，连接产物冰上放置2min，加入1mL无抗生素LB液体培养基37℃、80rpm孵育1h后涂布至含有氨苄青霉素的LB固体平板上，过夜培养。

8.如权利要求1所述的敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤S4中，包括对嘌呤霉素筛选后的细胞进行扩培，慢病毒处理后待细胞传代培养后收集细胞，再对其基因组进行提取，且针对Mx基因不同靶位点，设计扩增对应靶位点引物。

9.如权利要求8所述的敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系的构建方法，其特征在于：所述引物包括sgRNA1-PF、sgRNA1-PR、sgRNA2-PF、sgRNA2-PR、sgRNA34-PF、sgRNA34-PR，其5’-3’序列分别如下：

sgRNA1-PF：GGTTGTTTGAGTCACTGAGCCA；

sgRNA1-PR：CAGTGTCCCACCTGCACATC；

sgRNA2-PF：AAGGTTAGCAGAGAGAGGGAGA；

sgRNA2-PR：ATTGGTAGGCTTTGTTGAGGTG；

sgRNA34-PF：AAATGGCCTGCCTTGGGTTT；

sgRNA34-PR：AGGTTGCTGCTAATGGAGGA。

10.如权利要求1所述步骤制得的敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系。