[发明专利]一种敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系及其构建方法

说明书

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系及其构建方法，包括如下步骤：S1、靶点选择及sgRNA的设计和合成；S2、构建pLentiCRISPR‑Mx‑sgRNA载体；S3、嘌呤霉素筛选阳性克隆；S4、慢病毒处理及T7E1酶切检测；S5、单克隆细胞株筛选，本发明成功构建靶点编辑鸡Mx基因的CRISPR/Cas9重组载体，实现鸡成纤维细胞DF‑1的Mx基因靶向编辑，获得Mx基因敲除细胞系，为后续Mx蛋白抗病毒机制研究提供实验材料和基础数据。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系及其构建方法。

背景技术

近年来随着CRISPR/Cas9等基因编辑工具的快速发展，通过靶向不同的基因，目前已实现高效的靶向基因编辑，且广泛应用于禽源细胞系的构建，以研究宿主对特定病原体的易感性以及特定基因在宿主与病原体中的相互作用。

DF-1细胞是一种永生化的鸡成纤维细胞系，目前已广泛利用该细胞研究禽病原体与禽宿主之间的相互作用，如甲型流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒和逆转录病毒。Mx蛋白作为I型干扰素诱导所产生的抗病毒蛋白之一，具有广谱的抗病毒活性，尤其在抑制负链RNA病毒方面发挥重要作用，获得Mx基因修饰的鸡细胞，有助于为Mx基因抗病毒机制研究提供材料。

而在研究Mx基因的抗病毒机制时，DF-1上不仅仅只具有Mx基因，因此很难对Mx基因的抗病毒机制进行单一变量研究，从而导致研究进展缓慢。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系及其构建方法，从而方便对Mx基因的抗病毒机制的研究

为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

一种敲除抗病毒蛋白Mx基因的鸡成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、靶点选择及sgRNA的设计和合成；

S2、构建pLentiCRISPR-Mx-sgRNA载体；

S3、嘌呤霉素筛选阳性克隆；

S4、慢病毒处理及T7E1酶切检测；

S4、单克隆细胞株筛选。

优选地，所述sgRNA包括sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3及sgRNA4，其序列分别为：

sgRNA1：GTGATTGGAGACCGGAACTC；

sgRNA2：TACTTGCTCCCTACAAGGAG；

sgRNA3：GCGTTTACTTGCTCCCTACA；

sgRNA4：AAAGTCTACCAGGTATTGGT。

优选地，所述步骤S2中，包括如下步骤：

A、酶切pLentiCRISPR v2骨架载体；

B、回收酶切后的线性化pLentiCRISPR v2骨架载体，将其与退火后的sgRNA双链进行连接。

优选地，利用BsmBⅠ酶对pLentiCRISPR v2骨架载体进行酶切。

优选地，所述步骤B中，连接体系包括：5μL Ligation solutionA、1μL双链sgRNA、2μL线性化pLentiCRISPR v2载体、1μL Ligation solution C。

优选地，所述连接体系用ddH2O补至10μL。