[发明专利]一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测以及多克隆抗体的制备

权利要求书

1.一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测，其特征在于，包括以下步骤：

(1)毒素体外活性验证：采用Bradford试剂盒检测纯化后LT蛋白浓度，并用完全培养基将其稀释到100μg·mL-1，10μg·mL-1，1μg·mL-1，0.1μg·mL-1，0.01μg·mL-1。复苏Vero细胞进行传代培养，将消化下来的细胞计数并接种于24孔板中，37℃、5％CO2培养。细胞贴壁后设置LT蛋白处理组和空白对照组每组三个重复；培养3h后拍照观察细胞形态变化；

(2)毒素体内活性验证：本试验采用腹腔注射的方法；试验分两组，每组5只小鼠：试验组(腹腔注射LT 0.2mg·只)和对照组(腹腔注射等量PBS缓冲液)；试验开始后禁食不禁水，腹腔注射毒素后观察记录试验组症状，6h后称重，剖检时从幽门至肛门处取其肠段并称重；

(3)将纯化得到的蛋白进行浓度测定后取出等量4份每份1mL进行处理，处理完后测定每份浓度。

2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测，其特征在于，第一份直接保存于4℃，第二份直接保存于-80℃，第三份冻干后保存于4℃，第四份冻干后保存于-80℃。

3.一种大肠杆菌热敏肠毒素多克隆抗体的制备，其特征在于，将LT蛋白稀释到所需浓度后与弗氏佐剂等体积充分混合乳化，对5只小鼠进行免疫，免疫后一周以及试验结束时分别对小鼠进行预采血，用毛细管眼眶采血0.2mL左右置于37℃30min后将凝结好的血液在3000r·min-1离心15min收集上清用来检测抗体效价；血清抗体效价检测采用ELISA的方法，具体步骤如下：

(1)于96孔板中每孔滴加100uL，2ug·mL-1抗原，于4℃过夜；

(2)弃掉抗原，每孔加入200uL的封闭液，37℃孵育2h；

(3)弃掉封闭液，洗涤液洗板3次，弃干净残留液体；

(4)在第一孔加入阴性对照100uL，第二孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1小时；

(5)参照(3)洗板后，每孔加入100uL的HRP标记的兔抗小鼠二抗稀释液(1：10000稀释)，于37℃孵育1小时；

(6)弃掉液体，洗板3次拍干，每孔加入100uL的TMB，37℃孵育15min(根据颜色深浅来决定显色的时间)；

(7)每孔加入50uL的终止液(2N H2SO4)，在酶标仪上读取波长450nm处的吸光度值。

4.根据权利要求3所述的一种大肠杆菌热敏肠毒素多克隆抗体的制备，其特征在于，待进行免疫小鼠抗体效价检测完后对效价高小鼠进行眼球摘除采血，离心分离血清；抗血清用PBS等体积稀释，10000r·min-1离心15min，取上清；纯化首先将抗体纯化预装柱取出后用10mL结合缓冲液平衡，然后将稀释离心后的血清加入到平衡好的柱子中；过完柱子用10倍体积的PBS清洗抗体纯化柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白；然后用5mL抗体洗脱液洗涤柱子，并收集以得到特异性抗体；洗脱结束后用50mLPBS平衡柱，最后用20％的酒精封存柱子，4℃保存。在得到洗脱的抗体后，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体浓。

5.根据权利要求4所述的一种大肠杆菌热敏肠毒素多克隆抗体的制备，其特征在于，还包括对抗体灵敏度的检测；

将10ug LT蛋白进行连续10倍稀释后与5X上样缓冲液混合，100℃煮5min。然后参照2.2.5进行电泳，电泳结束后进行下列步骤：

(1)转膜。根据Marker条带裁胶，准备一张大小合适的PVDF膜，甲醇活化30s后按照滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序放入海绵垫夹层中，赶尽气泡。转膜在4℃条件下进行，200mA1.5h。

(2)封闭。将PVDF膜浸泡于5％脱脂奶粉中，室温摇床1h。

(3)孵育一抗。用5％脱脂奶粉按1:1000稀释一抗，4℃过夜孵育。TBST洗涤3次，每次10min。

(4)孵育二抗。羊抗小鼠-HRP二抗1：2000脱脂奶粉稀释，室温轻摇60min。TBST洗涤3次，每次15min。

(5)ECL显影。