[发明专利]一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测以及多克隆抗体的制备

说明书

本发明公开了一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测以及多克隆抗体的制备，包括以下步骤：毒素体外活性验证：采用Bradford试剂盒检测纯化后LT蛋白浓度，并用完全培养基将其稀释到100μg·mL‑1，10μg·mL‑1，1μg·mL‑1，0.1μg·mL‑1，0.01μg·mL‑1。复苏Vero细胞进行传代培养，将消化下来的细胞计数并接种于24孔板中，37℃、5％CO2培养。细胞贴壁后设置LT蛋白处理组和空白对照组每组三个重复；培养3h后拍照观察细胞形态变化。本发明提取的LT蛋白活性良好，冻干后4℃保存稳定性最优；多次免疫后制备出多克隆抗体这不仅体现了LT具有良好的免疫原性，还可以为后续检测提供帮助。

技术领域

本发明涉及中兽医技术领域领域，具体涉及一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测以及多克隆抗体的制备。

背景技术

经过纯化过程后的蛋白，蛋白活性、免疫原性以及稳定性都需要进行检测，因为在体外提取纯化蛋白的过程中，经历了各种条件的的变化，蛋白的生物活性与蛋白的三维结构、基团修饰以及所处的环境等密切相关，任何条件的改变都可能会影响到蛋白的生物活性。随着科学技术的发展，无论通过哪种途径获取目标蛋白，都可能导致蛋白失去原有的空间构象、基团修饰等，从而导致蛋白活性发生改变，这样就需要我们在体外对蛋白的活性做出新的判定。通过适合的方法对动物给药，或者刺激细胞观察形态学变化等都是检测蛋白活性的简便方法。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明提取的LT蛋白活性良好，冻干后 4℃保存稳定性最优；多次免疫后制备出多克隆抗体这不仅体现了LT具有良好的免疫原性，还可以为后续检测提供帮助。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：

一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测，其特征在于，包括以下步骤：

(1)毒素体外活性验证：采用Bradford试剂盒检测纯化后LT蛋白浓度，并用完全培养基将其稀释到100μg·mL-1，10μg·mL-1，1μg·mL-1，0.1μg·mL-1， 0.01μg·mL-1。复苏Vero细胞进行传代培养，将消化下来的细胞计数并接种于24 孔板中，37℃、5％CO2培养。细胞贴壁后设置LT蛋白处理组和空白对照组每组三个重复；培养3h后拍照观察细胞形态变化；

(2)毒素体内活性验证：本试验采用腹腔注射的方法；试验分两组，每组5 只小鼠：试验组(腹腔注射LT0.2mg·只)和对照组(腹腔注射等量PBS缓冲液)；试验开始后禁食不禁水，腹腔注射毒素后观察记录试验组症状，6h后称重，剖检时从幽门至肛门处取其肠段并称重；

(3)将纯化得到的蛋白进行浓度测定后取出等量4份每份1mL进行处理，处理完后测定每份浓度。

优选地，第一份直接保存于4℃，第二份直接保存于-80℃，第三份冻干后保存于4℃，第四份冻干后保存于-80℃。

优选地，将LT蛋白稀释到所需浓度后与弗氏佐剂等体积充分混合乳化，对 5只小鼠进行免疫，免疫后一周以及试验结束时分别对小鼠进行预采血，用毛细管眼眶采血0.2mL左右置于37℃30min后将凝结好的血液在3000r·min-1离心 15min收集上清用来检测抗体效价；血清抗体效价检测采用ELISA的方法，具体步骤如下：

(1)于96孔板中每孔滴加100uL，2ug·mL-1抗原，于4℃过夜；

(2)弃掉抗原，每孔加入200uL的封闭液，37℃孵育2h；

(3)弃掉封闭液，洗涤液洗板3次，弃干净残留液体；

(4)在第一孔加入阴性对照100uL，第二孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1小时；

(5)参照(3)洗板后，每孔加入100uL的HRP标记的兔抗小鼠二抗稀释液(1：10000稀释)，于37℃孵育1小时；