[发明专利]用于靶向敲降Htra2转录本的sgRNA、CRISPR/CasRx系统及应用

说明书

本发明公开了一种用于靶向敲降Htra2转录本的CRISPR/CasRx系统及应用，该系统包括特异性靶向Htra2 mRNA的sgRNA以及CasRx，并通过腺相关病毒载体递送，形成有效敲降Htra2转录本的RNA编辑系统。本发明通过实验评价所述的CRISPR/CasRx系统对新霉素诱导的小鼠听力损失的影响，结果发现该RNA编辑系统能特异性敲降小鼠中的Htra2转录本，且新霉素造模小鼠注射治疗系统后，可观察到听力功能的恢复，同时还观察到内外毛细胞存活率的提高、纤毛形态变规则，直观地验证了本发明提供的AAV‑CasRx治疗系统对氨基糖苷类药物导致的耳毒性损伤的改善作用，可用于制备防治获得性感音神经性聋的药物或保健品。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域、医药领域，具体涉及一种用于靶向敲降Htra2转录本的sgRNA、CRISPR/CasRx系统及应用。

背景技术

衰老、噪声、感染及耳毒性药物是引起人类后天获得性感音神经性聋的主要原因，其中，氨基糖苷类药物、顺铂药物等所致的耳毒性损伤在临床治疗中时有发生，如何避免和降低其诱导的内耳毒性一直是亟待解决的问题。然而，目前临床上对后天获得性感音神经性聋的治疗手段十分有限。

CRISPR-Cas9是现目前最强大的基因编辑工具，广泛应用于多种疾病的基因治疗，通过基因编辑的方法对获得性感音神经性耳聋进行干预已有研究报道，然而CRISPR-Cas9系统存在潜在的脱靶风险，Cas9蛋白可能会靶向切割与sgRNA序列相近的DNA序列，且CRISPR-Cas9编辑对基因组DNA的变化是不可逆的，其介导的永久敲除可能存在未知的副作用。此外，虽然RNA干扰(RNAi)可高效切割和抑制靶标转录本，但其会引起特异性的脱靶效应，这样的脱靶效应很难预测，也限制了该技术的实用性，特别是在治疗和临床应用方面。

CRISPR-Cas13是一种新型RNA编辑系统，其中，Cas13蛋白是一种2类VI型的CRISPR-Cas系统效应蛋白，具有RNA介导的RNA酶切活性，是目前第二大类CRISPR-Cas系统发现的唯一能够降解RNA的蛋白，比传统的RNA干预工具具有更高的特异性。Cas13蛋白家族已经鉴定出4个成员，包括Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d。有报道称CasRx(RfxCas13d)比其它Cas13s具有更高的活性和特异性。作为目前最小的Cas13酶，CasRx可以很容易地被包装进入AAVs载体，这使得CRISPR-CasRx系统在体内递送变得很方便。CasRx已被应用于肝脏和眼病小鼠模型的治疗工具，与其他基因编辑系统相比，RNA编辑系统可以在不改变基因组的情况下提供更安全的基因沉默方法，适合于后天获得性疾病。

然而，利用CRISPR-CasRx系统恢复体内功能的研究较少，能否利用CRISPR-CasRx系统来提供一种防治后天获得性感音神经性聋的方法，并提高现有基因编辑系统的特异性和效率，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明针对现有技术缺乏防治后天获得性感音神经性聋的问题，提供了一种用于靶向敲降Htra2转录本的sgRNA及RNA编辑系统，用以防治由氨基糖苷类药物、噪声等原因导致的耳毒性损伤，可用于制备防治获得性感音神经性聋的药物或保健品。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种用于靶向敲降Htra2转录本的sgRNA，所述sgRNA的序列选自SEQ ID NO：1-5所示序列中的任意一条。

优选地，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明另一方面还提供了一种用于靶向敲降Htra2转录本的CRISPR/CasRx系统，所述的CRISPR/CasRx系统包含前面任一所述的sgRNA和CasRx蛋白。

优选地，所述的CRISPR/CasRx系统通过腺相关病毒载体递送。

进一步地，所述的腺相关病毒为AAV-PHP.eB病毒。