[发明专利]一种呈现TD1稳转细胞及其构建方法、呈现TD1工程化外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及分子生物领域，特别涉及一种呈现TD1稳转细胞及其构建方法、呈现TD1工程化外泌体及其应用，其中，稳转细胞的构建方法为包括如下步骤：S100、将透皮肽TD1基因序列插入到外泌体膜蛋白的基因序列中获得融合蛋白表达载体；S200、将所述S100制得的融合蛋白表达载体和包装质粒共同转染293T细胞得到慢病毒；S300、将所述S200制得的慢病毒感染间充质干细胞即得所述稳转细胞。本发明将透皮肽TD1定向表达在间充质干细胞的外泌体膜上，呈现TD1的间充质干细胞外泌体在小鼠皮肤上涂抹后，能够透过皮肤进入血液循环。该呈现TD1工程化外泌体可应用添加在涂抹型化妆品中，使其成分易于被皮肤的吸收。

技术领域

本发明涉及分子生物领域，特别涉及一种呈现TD1的稳转细胞及其构建方法、呈现TD1的工程化外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤位于人体表面，具有保护、感觉、分泌等功能，由表皮层和真皮层组成。皮肤细胞的细胞外基质参与维持皮肤弹力和皮肤细胞的生长，含有胶原蛋白和弹性蛋白等成分。在年龄增长、紫外线照射等因素作用下，皮肤会出现干燥、细纹、皮下脂肪减少等老化现象。

干细胞是一种具有自我增殖和多向分化潜能的细胞。间充质干细胞(MSC)属于干细胞的一种临床使用，间充质干细胞多来源于脐带、脂肪或骨髓。间充质干细胞可分化为脂肪细胞、成骨细胞、上皮细胞等不同的细胞类型，如果移植进入人体，可产生归巢行为，迁移到靶向组织。间充质干细胞能够分泌EGF、bFGF等细胞因子等，促进成纤维细胞的迁移和增殖，促进胶原蛋白的合成，而改善皮肤状态。皮下注射MSC可以促进伤口痊愈和皮肤再生。但是，异体MSC具有一定的免疫原性，且分离得到的MSC数量比较有限。

外泌体是具有完整膜结构的纳米尺寸(30-100nm)的小泡，包含蛋白质、mRNA、脂质等内容物，作为细胞间的信使由上游细胞产生并转运至下游细胞。多种细胞可以产生外泌体，间充质干细胞产生的外泌体，免疫原性较低，且经过分离纯化可以得到大量的外泌体，因此经常用于临床。研究表明，MSC外泌体同样可以促进真皮层成纤维细胞的迁移和胶原蛋白的合成，从而改善皮肤状态，静脉注射MSC外泌体能够促进小鼠皮肤伤口的愈合。

天然外泌体存在一些膜蛋白，如ALIX，tsg101,Lamp2，以及四跨膜蛋白CD63、CD9和CD81，这些膜蛋白在多种细胞外源的外泌体中都有表达，且含量丰富，因此已经作为外泌体检测的标志蛋白。

皮肤外表面有一层表皮细胞组成的富脂结构，称为角质层，因为角质层的存在，大的亲水分子很难透过皮肤被人体吸收。把外泌体放在皮肤上，少量的外泌体通过皮肤的渗透作用可以进入皮肤，但是难以达到作用浓度。

透皮肽(TD1)是一种11个氨基酸的多肽(氨基酸序列：GCTTGTTCTTCTTCCCCATCTAAGCATTGTGGG)，研究表明，TD1可以直接透过皮肤，进入人体血液循环。同时，TD1可以增加蛋白质和多肽的表皮运输，含有TD1的融合蛋白也可以直接透过皮肤，进入人体血液循环，同时不会导致皮肤发炎、损伤和过敏。

如公开号为CN113521306A(公开日为2021年10月22日)的专利文件所公开的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的其制备方法包括：间充质干细胞外泌体的提取分离；载有小分子肽的传递体制备；透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的构建；植物精油凝胶的制备；得到具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂。该传递体-外泌体膜融合制剂能显著改善小分子肽的载药量，与传统脂质体相比具有更高的变形性、更优异的透皮效果，与具有透皮作用的植物精油协同起效，以更好地促进功效美容成分向皮肤深层的渗透。

发明内容

为提高间充质干细胞产生的外泌体对皮肤的渗透作用，本发明将透皮肽TD1定向表达在MSC外泌体的表面，使呈现TD1的MSC外泌体在TD1的带领下穿过角质层，进入表皮层和真皮层，改善皮肤状态。

第一方面，本发明提供一种呈现TD1稳转细胞的构建方法，其包括如下步骤：