[发明专利]氧气浓度梯度微环境的构建方法及其应用

说明书

氧气浓度梯度微环境的构建方法及其应用，其属于荧光检测仪器的技术领域。该方法利用微流控芯片中微米级的腔室通道构建氧气分压微环境，装置体积小、成本低、气体平衡用量少、浓度梯度构建时间短，能够避免空气中氧气分压的干扰，而且可以同时构建两种及以上的氧气微环境，适用于多种氧气分压环境的并行调控及测试。该体系气体浓度梯度稳定，测试通道形式灵活多变，应用范围广泛。比如，可以对测试区域进行稳定的氧气分压调控；可以对溶液中氧气敏感探针的响应响应曲线进行快速检测；由于装置底部为透明玻璃片，能够配合常规荧光成像/荧光寿命成像仪器，还可以进行活细胞实验，用于定量分析活细胞在氧气浓度梯度分压环境中对氧气浓度的响应情况。

技术领域

本发明涉及一种氧气浓度梯度微环境的构建方法及其应用，其属于荧光检测仪器的技术领域。

背景技术

氧气是最常见的气体之一，许多化学反应以及细胞的生理活动都与氧气浓度息息相关，生物组织及细胞内的氧气含量通常反映相应的生理状态，特别是一些疾病在发展初期，会导致相应的生理微环境氧气浓度的改变。因此，对氧气微环境进行精确的调控及检测，对科学研究、环境监测、健康卫生及癌症诊疗等方面都具有重要意义。

传统的构建氧气分压的方法主要为使用气瓶在溶液中鼓气，其缺点是气体平衡时间长、消耗气体多、每次平衡只能获得氧气浓度环境，如需构建多种氧气环境，还需要准备数量众多的气瓶，十分不便，而且该方法难以应用于构建活细胞的氧气测试微环境，也无法与传统成像系统相配合，实时调控和检测活细胞内部的氧气分压。目前，缺少一种高效的方法，能够准确构建氧气分压微环境，不仅能够应用于普通液体，还能应用于活细胞的氧气微环境构建和实时监测。

比如，2019年诺贝尔生理医学奖就颁发给了细胞的氧气感受器HIF-1的相关科学家，表彰他们“发现了细胞如何感知和适应氧气供应”，细胞感知到的外部氧气环境和自身内部对氧气环境的适应通常非同步，要能够精准的探究细胞内部和外部氧气分压的差异，就需要能够适用于活细胞培养的实时氧气调控与检测方法。

再比如，在荧光显微成像方面，时间分辨成像是一种结合长寿命发光染料来克服生物自发光背景的荧光成像技术，然而，由于目前产生长寿命的染料通常是通过三重激发态物种间接获得的，而三重态物种会非常容易被氧气淬灭，因此，氧气淬灭长信号的问题导致这一领域的发展受到限制。如果能在活细胞成像时对微环境中氧气浓度进行有效调控，将解决时间分辨成像/荧光寿命成像中长寿命信号被淬灭的问题，可以实现对溶液及细胞微环境进行高分辨率、高灵敏度的实时探测，进一步拓展一系列相关领域的发展。

发明内容

本发明的目的在于提供氧气浓度梯度微环境的构建方法，为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，包括以下步骤：

S1.试样的配制及注入

当测试样品为荧光染料溶液时：将其在溶剂中稀释到合适浓度，通入芯片主通道及测试腔室。

当测试样品为非贴壁细胞时：如细菌等，需要将其与氧气敏感探针孵育染色，根据染料性质进行离心和洗涤操作后，通入芯片主通道及测试腔室。

当测试样品为贴壁细胞时：如哺乳动物细胞等，将待测细胞通入芯片主通道中，在37℃细胞培养箱中培养12小时，细胞贴壁后，使用对氧气有荧光响应信号的荧光染料对活细胞进行染色，最后将细胞外多余荧光染料替换为无背景荧光的细胞培养液。

S2.氧气浓度梯度环境的建立

打开高氧阀，高氧分压的混合气体从高氧气瓶经高氧表后，由高氧入口进入到微芯片的高氧通道；然后高氧分压的混合气体从高氧出口经高氧出气管排至集气瓶；

同时打开低氧阀，低氧分压的混合气体从低氧气瓶输出，经低氧表后由低氧入口进入到微芯片的低氧通道；然后低氧分压的混合气体由低氧出口经低氧出气管排至集气瓶；