[发明专利]抗病毒蛋白免疫增强剂在H9N2禽流感灭活苗中的应用

权利要求书

1.抗病毒蛋白免疫增强剂在H9N2禽流感灭活苗中的应用，其特征在于：所述抗病毒蛋白免疫增强剂为鸡源抗病毒蛋白。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗病毒蛋白免疫增强剂为鸡源抗病毒蛋白IFITM1。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗病毒蛋白免疫增强剂是利用大肠杆菌原核表达的鸡源抗病毒蛋白IFITM1。

4.一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗，其特征在于：其包括抗原、疫苗佐剂和免疫增强剂，其中，所述免疫增强剂为鸡源抗病毒蛋白IFITM1。

5.如权利要求4所述的H9N2亚型禽流感灭活疫苗，其特征在于：所述抗原为灭活抗原，其为灭活的甲型流感病毒FZ株或通过反向遗传系统拯救成功含有甲型流感病毒FZ株的HA、NA基因和H1N1-PR8株6个内部基因的重组病毒HA+NA/PR8株，其中，甲型流感病毒FZ株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO:V 202171，保藏日期为2021年9月26日。

6.如权利要求4所述的H9N2亚型禽流感灭活疫苗，其特征在于，所述抗原采用甲醛灭活。

7.如权利要求1至3之一所述的抗病毒蛋白免疫增强剂在H9N2禽流感灭活苗中的应用方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1)将禽流感H9N2亚型疫苗毒株用灭菌PBS做1000倍稀释接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔中，再置于37℃孵育，48h后收获鸡胚病毒尿囊液，利用1％鸡红细胞做血凝试验，无菌收集HA效价≥256的病毒尿囊液，再保存于-80℃环境下；

2)抗原灭活：向步骤1)制得的鸡胚病毒尿囊液中加入终浓度为0.1％的甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合；然后置于37℃恒温摇床中以200～220r/min摇荡灭活12小时后取出，制得灭活的禽流感H9N2亚型疫苗毒株病毒液，将其置4℃环境下保存备用；

3)以1：2.81的比例分别加入步骤2)灭活的禽流感H9N2亚型疫苗毒株病毒液和疫苗佐剂，再加入抗病毒蛋白IFITM1作为免疫增强剂，使其在疫苗中的浓度为167_μg/mL，使用HR-500分散乳化机逐渐从A档到D档开始乳化，令其在低温条件下以15000r/min乳化30分钟。

8.如权利要求7所述的应用方法，其特征在于，步骤3)中，所述抗病毒蛋白IFITM1的制备方法为：使用H9N2禽流感病毒感染SPF雏鸡，感染后5天，取肺脏组织；参照GenBank中已发布的禽源IFITM1基因的编码区核苷酸序列设计引物，PCR进行目的条带的扩增，测序鉴定鸡源IFITM1的mRNA水平表达和基因序列；然后构建IFITM1的重组表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，经IPTG诱导和超声破碎后，SDS-PAGE电泳分析抗病毒蛋白表达，采用镍柱亲和层析进行纯化，纯化后抗病毒蛋白置4℃环境下保存备用。

9.禽用免疫增强剂抗病毒蛋白IFITM1在制备禽用疫苗中的应用。