[发明专利]一种壳聚糖亲和蛋白、酶的固定化方法及生物材料

说明书

本发明公开了一种壳聚糖亲和蛋白、酶的固定化方法及生物材料，所述壳聚糖亲和蛋白为由氨基酸序列SEQ ID NO.1编码的野生型壳聚糖酶经过其氨基酸第54位定点突变而产生的突变体，所述突变体为壳聚糖酶的突变体E54Q。本发明利用所述壳聚糖亲和蛋白与dit1Δ孢子壁壳聚糖层的亲和能力，实现酶蛋白在dit1Δ孢子中的固定化；本发明方法操作简便，不需要购买商品酶，大大降低了生产成本，且绿色环保，可大量制备并能重复使用。

技术领域

本发明属于固定化酶技术领域，具体涉及到一种壳聚糖亲和蛋白、酶的固定化方法及生物材料。

背景技术

二倍体酿酒酵母营养细胞在以醋酸盐为唯一碳源，并缺乏氮源的条件下，会进入减数分裂阶段形成四个单倍体的子囊孢子，经自然或人为破壁后，获得单个游离孢子。孢子壁有四层结构，从内到外依次为甘露糖层、葡聚糖层、壳聚糖层以及二酪氨酸层。酵母孢子固定化酶是基于孢子壁的特殊结构，以孢子作为一种固定化的生物材料，将酶表达或固定在孢子壁上。由于壳聚糖层对蛋白的交联作用及致密网状结构二酪氨酸层的拦截作用，在酵母孢子中表达分泌蛋白或带有分泌型信号肽的非分泌蛋白时，蛋白会被固定在壳聚糖层和二酪氨酸层之间，从而形成了孢子“微胶囊”固定化酶。

本发明使用一种酿酒酵母缺陷型菌株dit1Δ，该菌株缺失二酪氨酸层，其最外层为壳聚糖层。dit1Δ孢子作为一种生物固定化酶材料，在产孢的同时将酶蛋白展示在表面，经研究表明，dit1Δ孢子固定化酶的活性最高，但经反复使用后其酶活下降较快，不宜重复使用。因此，如何提高dit1Δ缺陷型酿酒酵母孢子固定化酶的活性及重复利用性依然是一个重大挑战。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

本发明的其中一个目的是提供一种壳聚糖亲和蛋白，将壳聚糖酶改造为壳聚糖亲和蛋白，将目的酶应用到基于壳聚糖亲和蛋白建立的固定化酶体系中，提高了孢子酶活，重复使用能力也得到显著改善。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种壳聚糖亲和蛋白，所述壳聚糖亲和蛋白为由核苷酸序列SEQ ID NO.1编码的壳聚糖酶经过其氨基酸第54位定点突变而产生的突变体，所述突变体为壳聚糖酶的突变体E54Q。

作为本发明壳聚糖亲和蛋白的一种优选方案，其中：所述核苷酸序列SEQ ID NO.1编码的壳聚糖酶来源于Bacilus subtilis 168。

本发明的另一个目的是提供一种DNA分子，所述DNA分子编码如上述所述的壳聚糖亲和蛋白。

本发明的另一个目的是提供一种质粒载体，所述质粒载体装载了如上述所述的DNA分子。

本发明的另一个目的是提供一种酿酒酵母菌株，其特征在于：酿酒酵母菌株装载有上述所述的质粒载体；所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母缺陷型菌株dit1Δ。

本发明的另一个目的是提供一种酶的固定化方法，包括，

将目的酶基因构建在含有如上述所述的壳聚糖亲和蛋白的表达质粒中，得到重组质粒；

将重组质粒转化到酿酒酵母缺陷型菌株dit1Δ中，得到酵母菌株；

对得到的酵母菌株利用二倍体酵母诱导产孢得到孢子固定化目的酶。

作为本发明酶的固定化方法的一种优选方案，其中：所述目的酶基因为α-半乳糖苷酶基因或β-木糖苷酶基因。

作为本发明酶的固定化方法的一种优选方案，其中：所述表达质粒为酿酒酵母质粒pRS426。