[发明专利]用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPRCas-SDA-AuNPs的细菌检测方法

权利要求书

1.一种用于检测细菌的试剂盒，其特征在于：包括SDA体系、CRISPR/Cas体系和DNA-AuNPs；

所述SDA体系包括Template、Primer、Bst3.0 DNA聚合酶、Nt.BbvCI切刻内切酶、dNTPs；

所述CRISPR/Cas体系包括Cas12a和crRNA，所述Cas12a和crRNA可识别细菌基因组并在识别出含有目标细菌基因组后可非特异性切割Template；

所述DNA-AuNPs上的DNA与SDA体系中Template和Primer在Bst3.0 DNA聚合酶和Nt.BbvCI内切酶作用下经过链置换等温扩增后产生的ssDNA链两端互补。

2.根据权利要求1所述的用于检测细菌的试剂盒，其特征在于：所述DNA-AuNPs为SH-DNA1和SH-DNA2与AuNPs混合孵育得到；

SH-DNA1序列为5’- TTG TCG TTG CGT GCT GA-SH-3’；

SH-DNA2序列为5’- SH-CCC AGG TTC TCT -3’；

Template序列为5’- CCC AGG TTC TCT TTG TCG TTG CGT GCT GAG GTT AGC AAA GTAGCG TG-3’；

Primer序列为5’- CAC GCT ACT TTG CTA A-3’；

crRNA序列为5’- UAA UUU CUA CUA AGU GUA GAU GGG CCU AGA UAA AGA AGA AC-3’。

3.根据权利要求2所述的用于检测细菌的试剂盒，其特征在于：所述DNA-AuNPs为SH-DNA1和SH-DNA2与AuNPs混合后于36-38℃振荡孵育10-50分钟，然后加入柠檬酸/盐酸缓冲液，震荡孵育振荡孵育8-12小时。

4.根据权利要求3所述的用于检测细菌的试剂盒，其特征在于：柠檬酸/盐酸缓冲液孵育时间为10小时。

5.根据权利要求2所述的用于检测细菌的试剂盒，其特征在于：所述DNA和AuNPs的最佳比例为200：1。

6.一种基于CRISPR/Cas-SDA-AuNPs的细菌检测方法，所述方法为非疾病诊断或治疗应用，其特征在于：其采用如权利要求1-5任一项所述的用于检测细菌的试剂盒；

所述方法包括以下步骤：

（1）采用CRISPR/Cas体系与待测试样进行酶切反应，得到酶切反应液；

（2）采用SDA体系对步骤（1）得到的酶切反应液进行扩增得到SDA扩增产物；

（3）将SDA扩增产物与DNA-AuNPs混合进行反应。

7.根据权利要求6所述的基于CRISPR/Cas-SDA-AuNPs的细菌检测方法，其特征在于：步骤（1）中酶切反应得到的酶切反应液先通过升温孵育进行Cas酶活性灭活，灭活后进行杂交反应使灭活过程中打开的杂交双链重新恢复为杂交双链，然后在步骤（2）中采用SDA体系进行扩增。

8.根据权利要求6所述的基于CRISPR/Cas-SDA-AuNPs的细菌检测方法，其特征在于：步骤（2）中所得到的SDA扩增产物通过升温孵育进行酶失活。

9. 根据权利要求6所述的基于CRISPR/Cas-SDA-AuNPs的细菌检测方法，其特征在于：步骤（3）反应后，通过光热检测，当存在创伤弧菌时，经过660 nm激光照射后，温度上升幅度小于无创伤弧菌的对照组。

10. 根据权利要求6所述的基于CRISPR/Cas-SDA-AuNPs的细菌检测方法，其特征在于：步骤（3）反应后，通过UV-vis检测，所述细菌为创伤弧菌，所述细菌浓度与步骤（3）得到的反应液于530 nm处吸光度值呈正比。