[发明专利]用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPRCas-SDA-AuNPs的细菌检测方法

说明书

本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPR/Cas‑SDA‑AuNPs的细菌检测方法。本发明引入CRISPR‑Cas系统，通过CRISPR/Cas12a特异性识别细菌和SDA进行检测信号放大，提出了基于CRISPR/Cas12a‑SDA和DNA‑AuNPs光热效应的细菌检测方法，可以实现对细菌的简便、快速、高灵敏检测。

技术领域

本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPR/Cas-SDA-AuNPs的细菌检测方法。

背景技术

细菌是引起许多疾病的重要病原体。快速、准确的细菌检测可以实现突发传染病病原体的早期诊断；可指导临床合理用药，减少因病原不明或经验性用药导致的日益严峻的耐药性问题。然而，当前传统的细菌检测技术如细菌培养方法非常耗时，聚合酶链式反应（PCR）或酶联免疫吸附试验（ELISA）依赖于昂贵的仪器设备和熟练的操作人员，无法满足医疗条件落后国家和地区的检测需求，也限制了它们在即时检测中的广泛应用。

基于纳米材料的即时检测方法在快速、灵敏和特异性的细菌检测方面引起了人们的兴趣。金纳米颗粒（AuNPs）是合成历史最悠久且应用领域最为广泛的纳米材料之一，具有与尺寸相关的光学特性，可以表现出一系列的颜色性质，分散的AuNPs在可见光范围内表现出典型的等离子体吸收。当发生聚集时，其吸收峰值红移，颜色由红色变为蓝色。由于这一特性，基于AuNPs的细菌比色检测法已被广泛应用于食品安全、疾病诊断等检测领域。该方法可以通过肉眼直观判断颜色变化，实现对目标物的定性或半定量检测。但为了实现其定量测量，往往需要借助于分光光度计等大型仪器，不适用于现场快速检测。

此外，现有的高灵敏核酸检测技术通常使用核酸扩增技术来进行信号放大，以进一步提高检测的灵敏度。链置换等温扩增反应（strand displacement amplification，简称为SDA）是一种基于限制性核酸内切酶和DNA聚合酶催化的连续切割和聚合/置换过程的酶促DNA体外等温扩增方法，具有效率高、特异性高、设备要求低等优点，尽管在核酸分析方面表现出明显的优势，但SDA无法直接用于细菌基因组的检测，往往需要与适体特异性结合。受制于高特异性适体的筛选，目前基于适体的SDA细菌检测方法往往存在特异性不高的问题。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPR/Cas-SDA-AuNPs的细菌检测方法。

本发明的第一方面，提供一种用于检测细菌的试剂盒，包括SDA体系、CRISPR/Cas体系和DNA-AuNPs；

所述SDA体系包括Template、Primer、Bst3.0 DNA聚合酶、Nt.BbvCI切刻内切酶、dNTPs；

所述CRISPR/Cas体系包括Cas12a和crRNA，所述Cas12a和crRNA可识别细菌基因组并在识别出含有目标细菌基因组后可非特异性切割Template；

所述DNA-AuNPs上的DNA与SDA体系中Template和Primer在Bst3.0 DNA聚合酶和Nt.BbvCI内切酶作用下经过链置换等温扩增后产生的ssDNA链两端互补。

优选的，所述DNA-AuNPs为SH-DNA1和SH-DNA2与AuNPs混合孵育得到；

SH-DNA1序列为5’- TTG TCG TTG CGT GCT GA-SH-3’；

SH-DNA2序列为5’- SH-CCC AGG TTC TCT -3’；

Template序列为5’- CCC AGG TTC TCT TTG TCG TTG CGT GCT GAG GTT AGC AAAGTA GCG TG-3’；

Primer序列为5’- CAC GCT ACT TTG CTA A-3’；