[发明专利]一种羰基还原酶突变体及其在制备R-扁桃酸中的应用

说明书

本发明公开了一种羰基还原酶突变体及其在R‑扁桃酸合成中的应用，属于生物合成技术领域。所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列通过易错PCR引入随机突变，并通过高通量筛选获得。本发明所述羰基还原酶突变体较未突变野生型羰基还原酶KAR酶活(17U/L)显著提高，达到了60.5U/L；催化苯甲酰甲酸还原制备R‑扁桃酸，原料转化率最高可达96％，具有工业应用前景。

技术领域

本发明涉及生物合成技术领域，具体涉及一种酶催化制备扁桃酸的方法。

背景技术

扁桃酸(Mandelic acid,MA)，化学名称a-羟基苯乙酸，CAS 90-64-2，化学式为C₈H₈O₃，分子量152.15，熔点118-121℃，易溶于水和乙醇。

手性扁桃酸是重要的氨基酸合成前体和药物中间体。R-扁桃酸是合成青霉素、头孢拉定等抗生素的重要中间体，还可以用于合成抗肿瘤药物Goniothalamusstyryllactones、治疗水肿和风湿疾病药物(+)-CrassalactoneA，目前市场上对手性扁桃酸的需求远远大于对其外消旋体的需求，因而手性扁桃酸成为热点的精细化工中间体。

光学纯扁桃酸生产方法主要有物理化学方法、化学法和生物催化法。物理化学方法主要包括毛细管电泳法和色谱分离法。色谱法中主要有高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)。色谱法不能够实现手性扁桃酸工业化大规模生产。化学法生产手性扁桃酸主要分为非对映体盐结晶拆分法、不对称合成法和电化学法等。采用化学法生产具有反应条件苛刻，环境污染大的缺点。

发明内容

本发明目的是用易错PCR方法对羰基还原酶基因进行改造，使改造后羰基还原酶针对苯甲酰甲酸的酶活性有所提高，使其符合在催化生产R-扁桃酸工业化应用的需求。

本发明采用的技术方案为：通过易错PCR方法随机引入突变碱基，经高通量筛选获得羰基还原酶突变体菌株。所述突变体是通过对来源于有害片球菌Pediococcus damnosus野生型羰基还原酶氨基酸序列(SEQ ID NO.2所示)引入随机突变获得。突变体序列第106位丙氨酸突变为亮氨酸。

本发明还涉及一种由所述羰基还原酶突变体构建的重组载体。

本发明提供一种由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。

本发明还提供一种所述羰基还原酶突变体在苯甲酰甲酸制备R-扁桃酸中的应用。

进一步地，在上述应用中，以苯甲酰甲酸为底物和pH＝7.5PB缓冲液为反应介质，在含有羰基还原酶突变体的重组基因工程菌存在下，进行还原反应后得到R-扁桃酸。

进一步地，在上述应用中，还原反应在水浴控温、磁力搅拌条件下进行。

进一步地，在上述应用中，酶源通过以含羰基还原酶突变体编码基因的重组工程菌经诱培养获得的菌液经裂解获得，所述酶源按如下方法制备：取不同突变体菌液以及未突变菌种18uL接种于1.8mL LB培养基(96孔板中预先加入1.8mL培养基)，同时加入2uL100mg/mLKan溶液，37℃振荡培养至菌体浓度OD 600nm约为0.6-0.8，15℃静置30min，之后加入2uL 200mg/mL IPTG溶液，16℃振荡诱导24h。使用96孔板离心机进行离心；离心后沉淀加0.2mL裂解液重悬，超声破碎，4℃，3000×g，10min离心，破碎上清保留，用于酶活分析。

突变体羰基还原酶KARase-F106L(氨基酸序列为SEQ ID NO.3)的催化活力较野生型酶活(17U/L)有显著提高，分别达到了60.5U/L。本发明实施例中转化率可高达到96％，R-扁桃酸对映选择性达到100％ee，是一种全新环保节能、高效R-扁桃酸的合成工艺。

具体实施方式