[发明专利]一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用，该杆状病毒载体包含外源基因表达盒与稳定序列，所述稳定序列位于距离所述外源基因表达盒的5kb以内，所述稳定序列为CNE序列或NAE序列。本发明将CNE(或NAE)序列构建至重组杆状病毒载体上的外源基因表达盒附近，使得携带产生AAV所必需的功能蛋白表达盒或ITR核心表达元件等外源基因表达盒的重组杆状病毒感染昆虫细胞，在连续传代多代后，重组杆状病毒和rAAV的生产水平仍能保持相对稳定。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用。

背景技术

重组腺相关病毒(rAAV)是目前基因治疗领域最具应用前景的载体之一。目前，生产rAAV的体系主要有两大类：一种是利用哺乳动物细胞(如293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞等)的常规生产体系；另一种是利用昆虫细胞的生产体系。在哺乳动物细胞生产体系中，单个细胞的rAAV颗粒产量低，并且培养中极可能存在污染的风险，这限制了rAAV在哺乳动物细胞中的大规模生产及应用。

为了克服上述问题，已开发了利用杆状病毒感染昆虫细胞制备rAAV的生产系统，即将提供AAV的rep基因、cap基因和ITR核心表达元件分别通过Tn7转座整合到3种不同的杆状病毒基因组中，利用这3种重组杆状病毒共感染昆虫细胞制备rAAV(Urabe等，2002，Hum.Gene Ther.13:1935-1943；US20030148506；US20040197895)。

然而，由于重组杆状病毒自身的不足，即在连续传代过程中外源基因容易丢失，使得含有AAV基因组的重组杆状病毒经过多次传代会不稳定，导致rAAV的产率下降。现有的重组杆状病毒载体不适合于对稳定性要求很高的大规模批量化的rAAV生产和应用，因此，用于生产基因治疗载体药物仍然有很大的改进需求。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用，旨在解决利用重组杆状病毒制备rAAV存在传代不稳定的问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种杆状病毒载体，包含外源基因表达盒与稳定序列，所述稳定序列位于距离所述外源基因表达盒的5kb以内，所述稳定序列为CNE序列或NAE序列。

优选地，所述外源基因表达盒为AAV的cap基因表达盒、AAV的rep基因表达盒和带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件中的至少一个；所述稳定序列位于距离所述cap基因表达盒的起始端和末端、所述rep基因表达盒起始端和末端以及所述带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件的一端和另一端中的至少一处的5kb以内。

优选地，所述外源基因表达盒为所述cap基因表达盒和所述rep基因表达盒。

优选地，按从5’至3’的顺序包含所述cap基因表达盒、所述稳定序列和所述rep基因表达盒。

优选地，按从5’至3’的顺序包含所述rep基因表达盒、所述稳定序列和所述cap基因表达盒。

优选地，所述稳定序列位于所述cap基因表达盒与所述rep基因表达盒之间，且其两端分别靠近所述cap基因表达盒的起始端和所述rep基因表达盒的起始端。

优选地，所述外源基因表达盒为所述带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件。

优选地，所述外源基因表达盒为所述带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件和所述cap基因表达盒。

优选地，所述外源基因表达盒为AAV的rep78基因表达盒，所述杆状病毒载体还包含AAV的rep52基因表达盒，所述稳定序列位于所述rep78基因表达盒与所述rep52基因表达盒之间。