[发明专利]一种用于昆虫细胞中产生重组杆状病毒的组合物、方法及应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种用于昆虫细胞中产生重组杆状病毒的组合物、方法及应用，该组合物包含包装缺陷型杆状病毒质粒和第一拯救重组DNA，包装缺陷型杆状病毒质粒缺失杆状病毒基因组中的CNE序列和/或NAE序列，第一拯救重组DNA包含第一插入序列以及位于第一插入序列两侧的第一同源臂，第一插入序列包含第一功能片段和第一回补序列，第一回补序列为包装缺陷型杆状病毒质粒所缺失的序列中的至少一个，所述组合物能够在昆虫细胞中发生同源重组以产生重组杆状病毒。利用本发明提供的组合物只需在宿主昆虫细胞中一步重组即可获得重组杆状病毒，无需筛选，并且没有单一重组位点的限制，制备重组杆状病毒纯度更高。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种用于昆虫细胞中产生重组杆状病毒的组合物、方法及应用。

背景技术

杆状病毒是一类具有囊膜包裹的环状双链DNA病毒。目前研究较多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(Autographacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclearpolyhedrosis virus，MNPV)，简称AcMNPV。杆状病毒表达系统(BEVS)是一种利用昆虫杆状病毒载体感染宿主昆虫细胞生产外源蛋白的真核表达系统。

Kitts等人研究提出了BacPAK杆状病毒表达系统，该系统将lacZ基因插入到多角体病毒基因座位置，通过在orf1629和orf603基因位点各引入一个Bsu36 I酶切位点构建了一种经Bsu36 I酶切后线性化的复制缺陷型病毒，线性化后的病毒，由于缺失了必需基因orf1629，即使自连也无法产生有感染活性的病毒，将拯救重组DNA转移载体与线性化的病毒共转染宿主昆虫细胞，同源重组后获得重组杆状病毒。然而，由于Bsu36 I酶不能100％切割病毒DNA使之线性化，重组病毒仍需要进行空斑筛选，耗时耗力。

随后，Lee等人研究提出了Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，该系统在AcMNPV的多角体基因位点引入Bac人工染色体元件，该元件含有mini-F复制子和Tn7转座位点，使得杆状病毒DNA能在细菌中进行复制，同时能通过Tn7转座将外源基因插入到病毒基因组中，获得重组杆状病毒。虽然该系统不需要进行空斑筛选，但需要在细菌中进行转座重组筛选，同样耗时耗力；且通过该系统获得的重组杆状病毒在连续传代中存在不稳定的现象。

在2003年，zhao等人研究提出了flash-BAC系统，该系统在AcMNPV基因组中引入mini-F复制子的同时失活了必需基因orf1629，失活了必需基因orf1629的杆状病毒无法产生有感染活性的病毒，除非与拯救重组DNA转移载体发生同源重组。该系统结合了BacPAK和Bac-to-Bac的优点，只需在宿主昆虫细胞中一步重组即可获得重组杆状病毒，无需筛选。然而由于orf1629是一种与复制相关的反式元件蛋白，使得已发生同源重组的病毒DNA会提供orf1629的功能，并且由于没有发生同源重组的病毒DNA也会被包装，从而导致最终获得的重组杆状病毒不纯。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于昆虫细胞中产生重组杆状病毒的组合物、方法及应用，旨在解决现有利用flash-BAC系统产生重组杆状病毒过程中没有发生同源重组的病毒DNA也会被包装，且已发生同源重组的病毒DNA会提供orf1629的功能，导致重组杆状病毒不纯的问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种用于昆虫细胞中产生重组杆状病毒的组合物，包含包装缺陷型杆状病毒质粒和第一拯救重组DNA，所述包装缺陷型杆状病毒质粒缺失杆状病毒基因组中的CNE序列和/或NAE序列，所述第一拯救重组DNA包含第一插入序列以及位于所述第一插入序列两侧的第一同源臂，所述第一插入序列包含第一功能片段和第一回补序列，所述第一回补序列为所述包装缺陷型杆状病毒质粒所缺失的序列中的至少一个，所述组合物能够在昆虫细胞中发生同源重组以产生重组杆状病毒。

优选地，所述第一功能片段为AAV的cap基因表达盒和AAV的rep基因表达盒。