[发明专利]一种以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种以葡萄糖为碳源合成2’‑岩藻糖基乳糖的菌株及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。所述菌株将重组质粒pACYCDuet‑J23115‑LacY和ptrc99a‑ManCB‑Gmdfcl‑FucT共转化到大肠杆菌获得。采用本发明提供的菌株以葡萄糖为碳源来合成2’‑岩藻糖基乳糖，产量为3.2g/L。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株及其构建方法和应用。

背景技术

人乳寡糖(human milk oligosaccharides，简称HMO)是人类乳汁中独有的物质，迄今已发现了200多种，多由3～6个糖基组成。大部分人乳寡糖都含有L-岩藻糖，例如2'-岩藻糖基乳糖(简称2'-FL)、6'-唾液酸乳糖(6'-SL)、乳糖-N-新四糖(LNnT)等；其中三糖2'-FL的占比很高，达人乳寡糖总量的30％。2'-FL已被证明对婴幼儿免疫系统成熟起到关键的促进作用，显著降低婴幼儿得病率；还能改善肠道菌群关系、促进大脑认知发育，是大健康产业关注的热点问题。

近期研究表明，2'-FL食用后可被肠道益生菌利用，有效调节肠道菌群；还可抑制弯曲杆菌与人肠粘膜的结合来减少婴幼儿腹泻，数据表明：2'-FL可使空肠弯曲杆菌对人体的侵袭能力降低80％，从而抑制肠道粘膜促炎因子和信号的释放，并减少婴儿由空肠弯曲杆菌引发的腹泻；2'-FL还可以通过调节人肠道上皮细胞CD14的表达来减轻炎症。所以在奶粉中添加适量2'-FL可以增强新生婴儿的免疫力，有效增强婴儿体质。2'-FL可以通过提高非致病菌共生体的竞争优势来间接抑制致病菌的生长，并能直接充当抗黏附抗菌剂减少微生物感染，使摄入2'-FL的婴儿不容易患由肺炎链球菌、绿脓杆菌引起的中耳炎。此外，2'-FL在大脑发育、神经元传递和突触的形成中也起作用，能够刺激大脑发育，所以在饮食中添加2'-FL可以促进大脑发育并且能够改善学习和记忆能力。由于2'-FL针对婴幼儿的卓越生理功能，以及我国母乳喂养率的逐年下降，导致2'-FL成为食品添加剂市场上急需的新产品。然而牛奶、羊奶中都不含有这种物质，所以2'-FL只能通过人工合成来大量获得。在技术手段上，化学合成2'-FL的步骤多、产量低，不能满足规模化使用的需求。微生物发酵法已被证明具有很强的可行性，因而如何提高2′-FL的生产规模、满足工业化生产食品添加剂的成本要求，是亟待解决的问题。

已报道的生产方法一般使用甘油作为发酵碳源，通过高密度发酵及合成来获得较高的2′-FL产量。然而甘油在发酵过程中不便于实时测定其含量，残留的甘油也较难与产物完全分离。使用葡萄糖为碳源生产工艺更为便利，成本也低于甘油，但葡萄糖效应会导致菌株体内乳糖操纵子上的β-半乳糖苷透性酶LacY基因无法转录表达，这将阻断乳糖进入细胞，导致2′-FL无法合成。将LacY在菌株体内由独立运作的启动子来过表达可以解决这一问题，然而LacY属于膜结合蛋白，过量表达会对菌株产生毒害作用，造成其生长缓慢甚至死亡。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株及其构建方法和应用，采用本发明提供的菌株以葡萄糖为碳源来合成2’-岩藻糖基乳糖，产量为3.2g/L。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株，将重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY和ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT共转化到大肠杆菌获得；

所述重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY是将质粒pACYCDuet-1与LacY基因连接，并将质粒pACYCDuet-1中的T7启动子替换为J23115启动子；

所述重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT是将质粒ptrc99a与ManCB基因簇、Gmdfcl基因簇、FucT基因、质粒ptrc99a的trc启动子、质粒ptrc99a的终止子连接后得到。