[发明专利]一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、探针以及检测方法

说明书

本发明属于生物检测的技术领域，具体涉及一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、探针以及检测方法。所述RPA引物中引物F和R的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的核酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。本发明的用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针，从临床判断为感染或疑似感染鰤诺卡氏菌组织中快速准确地检测岀鰤诺卡氏菌，该方法体现出较强的特异性，以及其检测灵敏度均较常规PCR更高，检测限度达到60 pg/μL，还可以对不同来源的鰤诺卡氏菌进行检测，这对鰤诺卡氏菌病的早期诊断、早期治疗等方面具有重要意义，同时还可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

技术领域

本发明属于生物检测的技术领域，具体涉及一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、探针以及检测方法。

背景技术

鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae）是革兰氏阳性丝状杆菌，属于放线菌目（Actinomycetales）、诺卡氏菌科（Nocardiaceae）、诺卡氏菌属（Nocardia），1967年在日本五条鰤（Seriola quinqueradiata）中首次分离发现，随后陆续在北美、欧洲、大洋洲的多种海水和淡水鱼类中被报道。该菌宿主范围广，已在多种鱼类如大黄鱼（Larimichthys crocea）、乌鳢（Channa argus）、大口黑鲈（Micropterus salmoniodes）暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）、罗非鱼(Tilapia mossambica)、招财鱼(Osphronemus goramy)等发现。鰤诺卡氏菌感染在环境温度为25~28℃时发病最严重，气温下降后发病情况有所缓解，该病菌感染持续时间长，病鱼前期无明显症状，中期开始表现出少食、反应迟缓等症状，后期出现体表溃烂出血、肛门红肿、腹部肿大，病鱼肝、脾、肾、肌肉等出现大量肉眼可见的白色结节等临床表现，从发病到死亡需要2周左右，自然发病率为35~60%，如能早期诊断、早期治疗常可控制或痊愈，否则会很难治疗甚至出现大量死亡，是目前影响加州鲈和乌鳢养殖产业健康持续发展的主要病害，每年因该病带来的经济损失也非常大。因此，开发鰤诺卡氏菌的早期快速检测技术，对鰤诺卡氏菌病早期诊断、早期治疗具有重要的意义。

现有的鰤诺卡氏菌病检测方法主要有传统生理生化鉴定方法和分子生物学方法，其中传统生理生化鉴定方法包括采用生化管鉴定或采用微生物鉴定系统；分子生物学方法包括普通PCR和荧光定量PCR方法，上述方法有的耗时长，有的需要昂贵的设备，有的检测灵敏度不够高或者容易出现假阳性现象，因此研发灵敏、快速的检测方法是本领域不断探索的课题。

鰤诺卡氏菌是一种生长缓慢的革兰氏阳性菌，生长周期为3~7天，因此传统生理生化鉴定方法不适合进行诺卡氏菌的快速检测。例如，普通PCR操作繁琐、交叉污染的风险较高，检测时间也较长，一般需要1~1.5 h，不适合鰤诺卡氏菌的快速检测；荧光定量PCR方法的绝对定量依赖于Ct值和标准曲线，对于低拷贝的靶基因或模板差异倍速不大的情况下，该技术的检测敏感性和精确度会受限制；LAMP方法需要使用的引物多达4~6条，对扩增的目的基因片段的特异性要求非常高，增加了污染风险，容易出现假阳性的情况；以及RAA方法，扩增后需要通过凝胶电泳观察结果，均不利于现场的快速检测。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、探针以及检测方法。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物，所述RPA引物为基于陈国权等（“鱼类鰤鱼诺卡氏菌特异性PCR检测方法的建立”2020）报道的鰤诺卡氏菌特异性序列设计得到，所述引物F和R的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；