[发明专利]一种人工虎骨多肽及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种人工虎骨多肽及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，制备过程如下：首先取1g人工虎骨粉于300mL超纯水，80℃水浴提取4小时，离心取上清即得人工虎骨多肽溶液，将上述溶液经过3KD超滤膜超滤，收集滤过液，‑40℃真空冷冻干燥；然后采用Superdex^TM peptide 10/300GL凝胶过滤分离，最后高效液相色谱纯化；本发明的人工虎骨多肽具有促进成骨细胞增殖和抗骨质疏松的作用，为骨质疏松症治疗提供一种可行性研究路径。

技术领域

本发明涉及生物医疗技术，尤其涉及一种人工虎骨多肽及其制备方法和应用。

背景技术

虎骨为虎的骨骼，出自《本草经集注》。虎骨，辛，甘，咸，温，古文中记载虎骨擅长祛邪气，定惊痫，强筋骨等作用，适用于关节痛、风寒湿痹、腰酸背痛等症状。古有虎骨追风丸、龙虎散、虎骨酒等方剂，现多用于治疗骨质疏松症。目前由于老虎是重点保护野生动物，因此虎骨禁止作为药材使用。但由于中医药的民间医疗卫生的需要，大量关于虎骨代用品的研究接踵而至，人工虎骨粉即是其中之一。人工虎骨粉已于2003年8月30日被国家食品药品监督管理局批准为一类新药，又名金天格胶囊。其采用非保护动物骨骼与天然虎骨进行对照分析研究，研发出与天然虎骨指纹图谱几乎相同的人工虎骨。与天然虎骨粉成分及安全性相似，具有强筋健骨的作用，用于腰酸背痛，腰膝酸软，下肢痿弱，行走困难等症状的改善。临床上人工虎骨粉用于主要用于骨质疏松症、骨折、类风湿关节炎等骨科疾病的治疗。

根据公开数据表明，人工虎骨骨粉的总氨基酸含量为16.82克/100克，与天然虎骨粉的16.06克/100克十分一致；采用HPLC分析人工虎骨粉与天然虎骨粉的肽及蛋白质的含量，均分得5个峰，两者在保留时间上基本一致；人工虎骨粉与天然虎骨粉有13种无机元素与微量元素相同。但目前关于人工虎骨中的活性多肽尚未见研究报道，人工虎骨的活性多肽的结构、活性及其提取制备工艺未知。发现人工虎骨中活性多肽及其结构和作用，有助于人工虎骨的二次开发。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种人工虎骨多肽及其制备方法和应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种人工虎骨多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

一种上述的一种人工虎骨多肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)取人工虎骨粉1g加入200ml的纯水中，80℃下水浴4h将其溶解，抽滤，取其溶解液。用3KD的超滤膜过滤，收集小于3KDa的多肽溶液，于-40℃真空冷冻干燥，得到多肽冻干粉末；

(2)采用Superdex^TM peptide 10/300GL凝胶过滤分离，将步骤1所得多肽冻干粉末过Superdex^TM peptide 10/300GL凝胶柱进行分离纯化。流动相为含体积比0.1％三氟乙酸和30％乙腈的水溶液，流速为1mL/min,蛋白层析仪检测波长280nm，收集洗脱峰，-40℃真空冷冻干燥。

(3)高效液相色谱纯化，将步骤(2)中得到的多肽过反相高效液相柱，色谱柱为Zorbax SB C₁₈(250mm×9.4mm,5μm)；柱温为室温；流动相为乙腈和水，梯度洗脱：0～30min，乙腈浓度从0％变至95％，洗脱速度2.5～3.0mL/min,紫外检测波长为220nm，按峰收集组分，获得人工虎骨多肽。

一种上述的一种人工虎骨多肽在制备促进成骨细胞增殖和抗骨质疏松方面的药物中应用。

与已有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提取了人工虎骨多肽，这种多肽在抗骨质疏松、促进成骨形成方面作用显著，为骨质疏松症治疗提供一种可行的研究路径，整体工艺步骤简单，耗材费较少，适合大量推广应用。

附图说明