[发明专利]聚乙二醇化蛋白药物中N-羟基琥珀酰亚胺的检测方法

说明书

本发明属于药物杂质分析技术领域，具体涉及一种聚乙二醇化蛋白药物中N‑羟基琥珀酰亚胺的检测方法。本发明提供的聚乙二醇化蛋白药物中N‑羟基琥珀酰亚胺的检测方法采用高效液相色谱法进行检测，色谱条件包括：色谱柱为极性基团修饰的反相色谱柱，流动相为磷酸盐缓冲液，进行等度洗脱。本发明提供的聚乙二醇化蛋白药物中N‑羟基琥珀酰亚胺的检测方法具有专属性强，线性关系优良且稳定，准确度和精密度高，耐用性好的优点，是一种较为理想的聚乙二醇化蛋白药物中N‑羟基琥珀酰亚胺的检测方法，可以有效的对PEG化蛋白药物中N‑羟基琥珀酰亚胺残留量进行监控，提高产品安全性。

技术领域

本发明属于药物杂质分析技术领域，具体涉及一种聚乙二醇化蛋白药物中N-羟基琥珀酰亚胺的检测方法。

背景技术

聚乙二醇(PEG)是经环氧乙烷聚合生成的一类高分子物质，它具有中性、无毒、无免疫原性、有良好的生物相容性等特点。同时它具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积。当PEG耦联到蛋白药物分子表面时，可改变其生物分配行为和溶解性，产生空间屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，避免了抗体的产生，同时空间屏障也保护了蛋白质不易被蛋白酶水解；另一方面蛋白药物分子与PEG耦联后，相对分子量增加，肾小球的滤过减少。这些都有助于蛋白药物的半衰期延长，从而达到提高药效，减少用药次数的目的。因此，PEG被广泛用于蛋白药物的修饰，以改善药物的体内性质。

蛋白药物的PEG化通常以其分子中的氨基、羧基和巯基等官能团为活性位点进行修饰。其中氨基修饰是最为常用的PEG修饰方法，以人促红素(EPO)的PEG修饰为例，EPO一般分子量在35～40KD左右，在适当的反应条件下，甲氧基聚乙二醇(mPEG-SBA)和EPO的N末端α-氨基或赖氨酸ε-氨基反应生成mPEG-EPO及N-羟基琥珀酰亚胺。反应式如下：

其中N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为反应的副产物，NHS是一种化学合成常用的医药中间体，该物质化学品安全技术说明书中有关毒理学影响的信息暂无数据资料，为了更好的对药品质量进行控制，需要对产品中的N-羟基琥珀酰亚胺残留量进行监控。

李增礼等发表了题目为《高效液相色谱法检测聚乙二醇化重组人干扰素α2b注射液中N-羟基琥珀酰亚胺含量》的论文，该检测方法的色谱条件为：流动相：20mmol/L PB(pH7.0)-145mmol/L NaCl-5％异丙醇；流速：0.6ml/min；色谱柱：TSK G3000SW(7.8mm×300mm，10μm)；柱温：25℃；检测波长：260nm；进样体积：200μL。建立检测PEG-IFNα2b注射液中NHS含量的HPLC方法，具有专属性、系统适应性及准确性良好；线性范围宽的优点。但是该检测方法的检测范围较窄，对蛋白质选择性较高，对于蛋白分子量15KD时可能会出现蛋白峰与目标峰无法分离的情况，而且该方法无法排除药物中可能存在的其他小分子物质对于NHS检测的干扰。

因此，有必要提供一种塔板数高，检测范围宽，对蛋白质分子量无限制，出峰时间快，峰型对称性好的PEG化蛋白药物中N-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法。

发明内容

为解决现有技术中的不足，本发明提供一种准确、可靠的聚乙二醇化蛋白药物中N-羟基琥珀酰亚胺的检测方法。该检测方法对蛋白质分子量无限制，适用于所有乙二醇化蛋白药物使用；具有塔板数高，塔板数大约为16000；约5min即可出峰，而且峰型对称性好的优点。

本发明提供了一种聚乙二醇化蛋白药物中N-羟基琥珀酰亚胺的检测方法，包括以下步骤：

S1样品制备：取聚乙二醇化蛋白药物反应液或各步骤纯化液作为样品溶液；

S2标准品制备：取100mgN-羟基琥珀酰亚胺，溶于10mL超纯水中，得10mg/mL的标准贮备液，将标准贮备液用磷酸盐缓冲液进行稀释，得标准品溶液；