[发明专利]人肠上皮化生气液界面模型的培养基、构建方法和应用

权利要求书

1.一种人肠上皮化生气液界面模型的增殖培养基，其特征在于：包括以下终浓度的组分：Wnt3a 30％-50％；R-spondin 1 15％-25％；human EGF10-50ng/ml；human FGF-1050-500ng/ml；human noggin50-500ng/ml；human gastrin5-50nM；B27 2％；N2 1％；Y-276321.5-7.5μM；A83-01 0.5-5μM；Nicotinamide5-50mM；HEPES10mM；Glutamax1％；AdvancedDMEM/F-12 18.45％-48.45％。

2.一种人肠上皮化生气液界面模型的分化培养基，其特征在于：包括以下终浓度的组分：human EGF10-50ng/ml；human FGF-1050-500ng/ml；human noggin50-500ng/ml；humangastrin5-50nM；B27 2％；N2 1％；Y-27632 1.5-7.5μM；A83-01 0.5-5μM；Nicotinamide5-50mM；HEPES10mM；Glutamax1％；Advanced DMEM/F-12 93.45％。

3.一种人肠上皮化生气液界面模型构建方法，其特征在于：是将获得的待培养人肠上皮化生细胞采用具有上下小室的细胞培养小室，上小室加入待培养人肠上皮化生细胞，下小室加入权利要求1所述的增殖培养基，在气液界面条件下进行培养。

4.根据权利要求3所述的一种人肠上皮化生气液界面模型构建方法，其特征在于：所述上小室加入待培养人肠上皮化生细胞，下小室加入所述增殖培养基，在气液界面条件下进行培养，具体包括：

将待培养人肠上皮化生细胞以1000-1250个/μl重悬于所述增殖培养基中并加至上小室，下小室中加入所述增殖培养基，于37℃、5％CO₂培养3天后去除上小室中的增殖培养基，开始气液界面培养，期间每3天去除上小室内粘液并更换下小室中的增殖培养基，培养1～2周得到该模型。

5.一种人肠上皮化生气液界面模型的增殖培养方法，其特征在于：采用具有上下小室的细胞培养小室，包括以下步骤：

(1)将获得的人肠上皮化生气液界面模型采用胰酶于37℃消化30min；

(2)将细胞收集至含FBS的Advanced DMEM/F12培养基终止消化，并计数；

(3)将细胞培养小室置于24孔细胞培养板，以10μg/cm²的浓度将胶原蛋白(Collagen)稀释后加至上小室，于37℃放置30-60min，吸去Collagen稀释液并用PBS洗2次；

(4)将步骤(2)获得的细胞以1000-1250个/μl重悬于权利要求1所述的增殖培养基中并加至上小室，下小室中加入所述增殖培养基，于37℃、5％CO₂培养3天后去除上小室中的增殖培养基，开始气液界面培养，期间每3天去除上小室内粘液并更换下小室中的增殖培养基，每2-6周传代一次，即重复步骤(1)～(4)，一共能传代至少6-10次。

6.一种人肠上皮化生气液界面模型的分化培养方法，其特征在于：是采用权利要求5所述的增殖培养方法获得的人肠上皮化生气液界面模型，该分化培养方法包括以下步骤：

将人肠上皮化生气液界面模型进行增殖培养后，去除上层小室内粘液，并吸去增殖培养基，加入权利要求2所述的分化培养基，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，期间每3天去除上层小室内粘液并更换所述分化培养基，培养6天。

7.一种人肠上皮化生气液界面模型，其特征在于：是采用权利要求3或4所述的构建方法或者权利要求5所述的增殖培养方法或者权利要求6所述的分化培养方法获得。

8.权利要求7所述的人肠上皮化生气液界面模型在药物效果评估上的应用。

9.权利要求7所述的人肠上皮化生气液界面模型作为细菌感染或者慢病毒感染模型的应用。

10.权利要求7所述的人肠上皮化生气液界面模型作为免疫细胞或间质细胞共培养模型的应用。