[发明专利]人肠上皮化生气液界面模型的培养基、构建方法和应用

说明书

本发明提供人肠上皮化生气液界面模型构建用培养基、构建方法和应用，其中增殖培养基由Wnt3a、R‑spondin 1、human EGF、human FGF‑10、humannoggin、human gastrin、B27、N2、Y‑27632、A83‑01、Nicotinamide、HEPES、Glutamax等成分组成，分化培养基由human EGF、human FGF‑10、human noggin、human gastrin、B27、N2、Y‑27632、A83‑01、Nicotinamide、HEPES、Glutamax等成分组成。通过该培养基，并采用具有上下小室的细胞培养小室成功构建了人肠上皮化生气液界面模型，实现了对现有动物模型系统的互补，该模型可以用于药物效果评估、作为细菌感染或者慢病毒感染模型以及作为免疫细胞或间质细胞共培养模型，可以更好的研究肠化发生的机制、用于临床前实验以确定可能的治疗方法并对患者进行个性化治疗。

技术领域

本发明涉及蛋白质冻干技术领域，具体涉及人肠上皮化生气液界面模型的培养基、构建方法和应用。

背景技术

胃癌(gastric cancer，GC)是全球癌症死亡的主要原因。我国胃癌的发病率位居第2位，仅次于肺癌。肠型胃腺癌是最常见的胃癌组织学类型，之前的研究表明肠型胃腺癌是通过明确的组织学状态发展起来的，从慢性胃炎开始，发展到肠上皮化生、不典型增生和癌症。肠上皮化生(intestinal metaplasia，IM)是指胃黏膜上皮被肠型腺上皮替代，出现吸收细胞、杯状细胞及潘氏细胞，有时还可见黏膜表面形成绒毛状结构。肠上皮化生是一种公认的癌前状态，目前是肠型胃腺癌发展中难以逆转的第一个关键步骤。关于肠化机制及可能治疗方法的研究工作受其模型进展的制约，目前尚无肠上皮化生细胞系及体外实验的公开报道。

自2010年，培养类器官的技术迅速发展，被“Science”评为2013年最大的科学进步之一，并被“Nature Methods”评为2017年生命科学领域年度技术。类器官利用干细胞在3D培养下形成“自组织”，能在体外模拟其来源组织器官的特定结构和功能，并具有自我更新和分化能力。目前国内外均已成功构建人胃上皮类器官，其优势包括：结构和功能仿真，能长期增殖(半永久、培养时间＞1年)，取材小，具有个体信息、适合个体化治疗等。然而类器官有一定的不足：如操作复杂(常需要类器官内微注射)，不具备黏液层，传代间隔短(一般7-10天，无法长期药物处理)。近年来发展起来的气液界面(air-liquid interface，ALI)培养模型则可弥补类器官的不足，能实现原代细胞培养中与类器官系统的互补，但ALI模型的成功建立存在一定难度，是目前业内比较热门也比较棘手的研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题和缺陷，本发明提供人肠上皮化生气液界面模型的培养基、构建方法和应用。本发明的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种人肠上皮化生气液界面模型的增殖培养基，包括以下终浓度的组分：Wnt3a 30％-50％；R-spondin 1 15％-25％；重组人表皮生长因子(humanEGF)10-50ng/ml；重组人成纤维细胞生长因子-10(human FGF-10)50-500ng/ml；重组人Noggin蛋白(human noggin)50-500ng/ml；人胃泌素(human gastrin)5-50nM；B27 2％；N21％；Y-27632 1.5-7.5μM；A83-01 0.5-5μM；烟酰胺(Nicotinamide)5-50mM；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)10mM；Glutamax1％；Advanced DMEM/F-12 18.45％-48.45％。