[发明专利]一种根瘤菌的双基因突变体及其应用

说明书

本发明提供一种根瘤菌的双基因突变体及其应用，属于农用微生物技术领域。为了在降低人工人本的前提下，减少根瘤的数量，解决了很难控制大豆根瘤数量的技术问题。本发明提供了一种根瘤菌HH103的双基因突变体所述双基因突变体是以根瘤菌为出发菌，将出发菌株中的NopT基因和NopP基因进行突变或者沉默获得的。经过数次实验和不同群体的验证表明HH103ΩNopTΩNopP能减少大豆的根瘤的数量，为后续研究大豆‑根瘤菌共生体系形成提供了基础，为提高大豆与根瘤菌的共生效率提供了可能性。

技术领域

本发明属于农用微生物领域，具体涉及一种根瘤菌的双基因突变体及其应用。

背景技术

氮元素是限制作物生长的最主要元素之一，但是土壤中能够被植物所利用的氮元素非常有限，主要还是由化学肥料来提供。然而，随着氮肥使用量的不断增加，这不仅抑制根瘤菌与豆科植物间的共生固氮作用，而且给生态环境带来了诸多不利的影响。所以，在无化学肥料供应的情况下，共生固氮可以为豆科植物的生长发育提供足够的氮源。在大豆根系被根瘤菌侵染后会形成共生根瘤，根瘤会通过生物固氮的的方式将空气中的氮气转化成氨为大豆提供氮源。增加大豆与根瘤菌间的固氮能力，既可以大幅度减少氮肥的使用，同时也可以提高大豆产量。因此，提高豆科植物自身的固氮能力对生态环境与农业发展具有重要意义。

豆科植物与根瘤菌的共生结瘤过程中有很多信号分子的传导参与，其中根瘤菌的Ⅲ型泌出系统分泌的Ⅲ型效应因子是最主要的信号分子之一，它影响着根瘤菌与宿主植物之间共生关系的建立。但是Ⅲ型效应因子是如何影响植物结瘤的分子机制还不清楚，以及根瘤菌与豆科植物间的互作基因还没有深入的研究。

大豆根瘤的数目是影响大豆共生固氮和生长情况的重要的因素，目前控制大豆根瘤菌的数量是没有办法通过人为来控制的，只能通过不断的更换根瘤菌摸索适合于接种大豆的根瘤菌维持稳定的根瘤数量，操作很麻烦并且工程量很大，未知的因素也比较多。现在急需一种可以控制大豆根瘤数量的方法。

发明内容

本发明的目的是为了在降低人工人本的前提下，减少根瘤的数量，解决了很难控制大豆根瘤数量的技术问题。

本发明提供一种根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HH103的双基因突变体，所述双基因突变体是以根瘤菌为出发菌，将出发菌株中的NopT基因和NopP基因进行突变或者沉默获得的。

进一步限定，所述NopT基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步限定，所述NopP基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步限定，获得双基因突变体的方法：将NopT基因和NopP基因与pJQ200SK载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌HH103中得到根瘤菌HH103的双基因突变体。

本发明提供一种减少大豆根瘤数目的试剂，所述试剂的有效成分是权利要求1-3任意一项所述的根瘤菌HH103的双基因突变体。

进一步限定，将权利要求5所述的试剂接种过表达GmPBS1基因的大豆幼苗或野生型大豆幼苗。

本发明提供一种减少大豆根瘤的方法，在大豆幼苗或过表达GmPBS1基因的大豆幼苗生长至对生真叶期，对大豆苗施用含上述的双基因突变体的菌液，接菌数量为大于2×10⁵个/株，培育接种菌液后的大豆30-40天。

进一步限定，其特征在于，所述菌液按如下方法制备：

(1)将上述的双基因突变体培养活化，控制OD₆₀₀为0.65-0.86；

(2)将步骤(1)得到的菌液离心，收集菌体并洗涤，再用硫酸镁溶液重悬菌体，使菌液OD₆₀₀达到0.2。