[发明专利]一种多靶标检测引物组及其设计方法

权利要求书

1.一种多靶标检测引物组的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：

序列片段筛选：获取目标靶标的参考基因组序列，以预定窗口长度进行滑动拆分，得到拆分序列，将所述拆分序列比对至数据库，保留能够唯一比对至目标靶标的拆分序列，得到保留序列，并将保留序列按照拆分位置进行连接，得到目标靶标的靶标特异性区域序列；

获得先验概率：获得检出目标靶标序列的临床样本的高通量测序数据，将所述高通量测序数据与所述靶标特异性区域序列进行比对，得到临床样本在所述靶标特异性区域序列上的覆盖区域；对所述靶标特异性区域序列进行引物对设计，得到引物对；分析每对引物是否被每个临床样本的覆盖区域所覆盖，统计得到每对引物被覆盖的临床样本数，即为该引物对可扩增生物样本数的先验概率；

形成引物池：按照上述方法获得若干种目标靶标的引物对及先验概率，将各种靶标的引物对按照先验概率由高至低排序，依次挑选各种靶标中排序在先的引物对加入引物池，并将在后加入的引物对与在已先加入的引物对进行兼容性评价，留用具备兼容性的引物对，弃用不具备兼容性的引物对并顺延至下一排序的引物对，直至纳入所有目标靶标的预定数量的引物对，形成可兼容引物池，即得多靶标检测引物组。

2.根据权利要求1所述的设计方案，其特征在于，所述目标靶标包括：病原体、耐药基因或癌症基因中的至少1类。

3.根据权利要求1所述的设计方案，其特征在于，所述目标靶标为病原体，所述高通量测序数据为mNGS数据，所述靶标特异性区域序列为物种特异性区域序列。

4.根据权利要求3所述的设计方法，其特征在于，所述序列片段筛选步骤中，得到目标病原体的物种特异性区域序列后，还对所述目标病原体的物种特异性区域序列进行聚类分析，相似度高聚为一类的序列仅保留其中一段，获得去冗余后的物种特异性区域序列。

5.根据权利要求4所述的设计方法，其特征在于，所述序列片段筛选步骤中，按照以下方法进行滑动拆分：将所述目标病原体所有株的参考基因组序列拆分成若干个窗口长度为30-150bp的序列片段，滑动间隔为1bp；

按照以下方法进行连接：将保留序列按照拆分位置进行连接得到连接序列，当所述连接序列≥150bp时，留用，得到所述目标病原体的物种特异性区域序列。

6.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述获得先验概率步骤中，采用以下方法进行引物对设计：每段物种特异性区域序列在扩增产物为80-150bp范围时输出若干对各异的引物对，同时每对引物满足GC含量为40％-60％，引物长度为18-27bp，退火温度为58-65℃。

7.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述形成引物池步骤中，还包括按照各靶标的排序依次挑选引物对，所述排序通过以下方法获得：以所述先验概率≥1的引物对为有效引物对，按照各靶标有效引物对数量由低至高排序，作为排序。

8.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述形成引物池步骤中，所述兼容性的评价标准为：以primer3-py软件模拟引物池中引物对形成引物二聚体得分，如得分≤5000，则认为具备兼容性。

9.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述形成引物池步骤中，所述预定数量为：当所述目标靶标为耐药基因时，引物对的数量≥1；当所述目标靶标为病毒时，引物对的数量≥3；当所述目标靶标为除结核杆菌外的细菌时，引物对的数量≥5；当所述目标靶标为真菌或结核杆菌时，引物对的数量≥10；当所述目标靶标为寄生虫时，引物对的数量≥10。

10.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，在所述形成引物池步骤后，还包括验证步骤，所述验证步骤为：另取临床样本，采用所述目标靶标检测引物组进行测试，替换在测序过程中实际形成引物二聚体的引物对。

11.权利要求1-10中任一项所述的设计方法得到的多靶标检测引物组。

12.一种用于多靶标检测的Panel，其特征在于，包含权利要求11所述的多靶标检测引物组。