[发明专利]一种多靶标检测引物组及其设计方法

说明书

本发明涉及一种多靶标检测引物组及其设计方法，涉及核酸检测技术领域。该方法通过筛选得到目标靶标的靶标特异性区域序列，再通过检出目标靶标的临床样本的高通量测序数据与靶标特异性区域序列进行比对，得到覆盖区域，引物对设计，分析，得到各引物对可扩增生物样本数的先验概率，最后按照引物对的先验概率由高到低排序，依次挑选排序在先的引物对加入引物池，并将后加入引物对和已先加入引物对进行兼容性评价，最终形成可兼容引物池，即得多靶标检测引物组。该设计方法适用生物样本类型广泛，不受生物样本类型、病原体类型、测序类型、panel大小的限制，确保优先挑选检测信号高的引物对，减少生物样本的异质性，提高检测的灵敏度。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，特别是涉及一种多靶标检测引物组及其设计方法。

背景技术

现有技术中的病原宏基因组学(mNGS)虽然是一种不依赖于培养，无偏向性地全面覆盖细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体的临床微生物鉴定领域的重要工具，但是mNGS的成本仍然比较昂贵(市场上单DNA检测产品都需要约3500元)，实验周期长(从样品进实验室到正常发出检测报告的周期普遍需要22小时)，且严重受宿主率的影响(去宿主操作后宿主率中位值约97.5％)，检测灵敏度受限。而基于文献搜索，以及本发明人对18万例临床样品统计分析，发现约150种病原体即可覆盖临床检测到的病原体数量的95％以上，也即是说只要能够同时快速高灵敏度地检测这约150种病原体，即可解决临床感染95％以上的问题。目前多重靶向扩增测序方法是针对这个需求最合适的解决方法，且成本低(仅需几百元成本)，实验简单且周期短，不受宿主率的影响，市场迫切需要一款这种快速灵敏优惠的产品。

然而虽然行业内普遍对这个多重技术有清晰的认知，但是却少有企业能够做出一款符合需求的产品出来。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种多靶标检测引物组的设计方法，该设计方法适用生物样本类型广泛，不受生物样本类型限制，不受病原体类型限制，不受测序类型限制，不受panel大小限制，确保优先挑选检测信号高的引物对，减少生物样本的异质性，提高检测的灵敏度。

为了达到上述目的，本发明提供了一种多靶标检测引物组的设计方法，包括以下步骤：

序列片段筛选：获取目标靶标的参考基因组序列，以预定窗口长度进行滑动拆分，得到拆分序列，将所述拆分序列比对至数据库，保留能够唯一比对至目标靶标的拆分序列，得到保留序列，并将保留序列按照拆分位置进行连接，得到目标靶标的靶标特异性区域序列；

获得先验概率：获得检出目标靶标序列的临床样本的高通量测序数据，将所述高通量测序数据与所述靶标特异性区域序列进行比对，得到临床样本在所述靶标特异性区域序列上的覆盖区域；对所述靶标特异性区域序列进行引物对设计，得到引物对；分析每对引物是否被每个临床样本的覆盖区域所覆盖，统计得到每对引物被覆盖的临床样本数，即为该引物对可扩增生物样本数的先验概率；

形成引物池：按照上述方法获得若干种目标靶标的引物对及先验概率，将各种靶标的引物对按照先验概率由高至低排序，依次挑选各种靶标中排序在先的引物对加入引物池，并将在后加入的引物对与在已先加入的引物对进行兼容性评价，留用具备兼容性的引物对，弃用不具备兼容性的引物对并顺延至下一排序的引物对，直至纳入所有目标靶标的预定数量的引物对，形成可兼容引物池，即得多靶标检测引物组。

本发明人在研究过程中发现，目前少有企业能够做出一款符合需求的多重靶向扩增测序方法产品，主要是因为下面几个方面的难点：