[发明专利]一种文库标签引物的质控方法及其应用

说明书

本发明涉及一种文库标签引物的质控方法及其应用，涉及基因测序领域。该质控方法包括以下步骤：制备待检质控品、构建第一文库、第一质控、构建第二文库、第二质控，其中通过滑动切割的方法得到待检质控品，采用PCR法构建第一文库、第二文库。该质控方法通过与合格的质控品形成一对一的关系构建相应文库，没有片段化和核酸分选的过程，相较于常规建库方法，该质控方法中采用的建库方法更加节省时间，进而提高文库标签引物的质控效率，易实现文库标签引物质控的规模化。

技术领域

本发明涉及基因测序领域，特别是涉及一种文库标签引物的质控方法及其应用。

背景技术

自1977年以来，从一代测序到如今的四代测序，基因测序技术呈现跨越式发展。概括来讲，以Sanger为代表的一代测序，采用先合成后测序的方式，分辨率高，测序片段长，质控环节多，污染低且结果直观可视，但成本高，测序通量低；二代测序，采用边合成边测序的方式，测序读长较短，相较一代测序时间更短，数据产出更高，错误率更低；三代测序，采用单分子测序的方法，相较二代测序速度更快，测序读长更长，覆盖率更均匀，但数据产出较低，错误率较高。

目前二、三代测序仪在产前筛查、肿瘤伴随诊断、病原体检测等领域广泛应用。以Illumina Next550测序仪在病原宏基因组学应用为例，其有4个流动槽(flowcell)，样本加载系统将单一样本/单一样本混池直接加载到4条泳道中进行簇生成和测序反应，4条Lane产生的总数据量达到400M reads；而对于病原宏基因组学应用来说，每个样本大约需要20M数据量，一张芯片能满足至少20个样本同时测序。测序仪器的测序能力要远大于测试样本序列量，为了提高数据利用效率，降低单样本成本，需要给不同样品加上特定的“标签”，从而可以在后续数据分析时将不同样品数据分开，而这个“标签”就是接头的index(即文库标签引物)，也常被称为barcode。

在进行临床样本检测前，需要在目的片段两端加上接头，即文库构建。以DNA文库构建为例，常规建库步骤为：(1)片段化，采用超声或内切酶的方式打断核酸；(2)末端修复，经T4 DNA聚合酶补平突出末端，经Klenow DNA聚合酶在3’端加A尾，经T4多聚合核苷酸激酶使5’端磷酸化；(3)接头连接，经连接酶在目的片段核酸两端连接含Index的接头；(4)扩增，在Taq酶和引物的作用下，使文库富集；(5)纯化，经磁珠分选后，得到目的大小范围内的文库。转座酶法建库的步骤为：(1)片段化，在转座酶的作用下打断基因组DNA并将通用接头连在断口处；(2)终止片段化，以防片段被打断的太小；(3)扩增，在Taq酶和引物(长接头，含Index)的作用下，使文库富集；(5)纯化，经磁珠分选后，得到目的大小范围内的文库。

病原宏基因组学作为应用于临床病原感染检测的新兴技术，具有无需培养、无偏好性等优点；也由于样本的多样性，病原宏基因组学检出病原体序列分布从个位到百万条序列。在检出高序列病原体情况下，样本间特异的“标签”分子即使存在较低的交叉污染，也会导致数据拆分过程样本A污染B的情况。此外每例样本测序数据量是基因覆盖度和检测临检度度的保障，以病原宏基因组学为例，每样本上20M数据量，当数据量低于5M时需要重测分析，扩增效率和拆分效率更均一的接头更好的保障数据量需求。因此需要一种高效、低成本的文库标签引物质检方案，以评估接头的交叉污染比例、数据产出比、编号一致性、芯片数据拆分率等参数。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种文库标签引物的质控方法，该质控方法通过与合格的质控品形成一对一的关系构建相应文库，没有片段化和核酸分选的过程，相较于常规建库方法，该质控方法中采用的建库方法更加节省时间，进而提高文库标签引物的质控效率，易实现文库标签引物质控的规模化。

为了达到上述目的，本发明提供了一种文库标签引物的质控方法，该质控方法包括以下步骤：