[发明专利]一种利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L-鸟氨酸产量的方法

权利要求书

1.一种利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L-鸟氨酸产量的方法，包括如下步骤：

(1)筛选遗传改造靶点基因：

分别用葡萄糖和甘露醇为唯一碳源，对谷氨酸棒杆菌MTL01进行培养，收集对数期样本进行转录组分析，获得基因表达差异详情表进行深度挖掘，设定p＜0.05阈值，挑选显著上下调基因，同时结合差异表达基因相关代谢途径分析得到3个可能对L-鸟氨酸产量有增益的靶点基因，包括2个显著上调基因qsuR和CGS9114_RS08985以及1个下调基因pdxR；

(2)构建重组质粒pK18-P_sod-qsuR、pK18-P_sod-CGS9114_RS08985和pK18-T-pdxR：

以谷氨酸棒杆菌S9114基因组为模板进行PCR，将强启动子P_sod分别插入2个显著上调基因qsuR和CGS9114_RS08985上游的非编码区，分别构建含有融合片段P_sod-qsuR基因和P_sod-CGS9114_RS08985基因的重组质粒pK18-P_sod-qsuR和pK18-P_sod-CGS9114_RS08985；

以谷氨酸棒杆菌S9114基因组为模板，通过PCR获得pdxR基因编码区插入T终止子的基因片段T-pdxR，将其一步克隆至谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB，构建含有T-pdxR基因的重组质粒pK18-T-pdxR；

(3)构建重组谷氨酸棒杆菌MTL14、MTL16和MTL19：

在谷氨酸棒杆菌MTL13基础之上，分别导入重组质粒pK18-P_sod-qsuR、pK18-P_sod-CGS9114_RS08985和pK18-T-pdxR，强化qsuR基因和CGS9114_RS08985基因的表达以及阻断基因pdxR的表达，得到重组谷氨酸棒杆菌MTL14、MTL16和MTL19；

(4)构建重组谷氨酸棒杆菌MTL21和MTL24：

将重组质粒pK18-P_sod-CGS9114_RS08985和pK18-T-pdxR分别导入重组谷氨酸棒杆菌MTL14，获得重组谷氨酸棒杆菌MTL21和MTL24；

(5)构建重组谷氨酸棒杆菌MTL25：

将重组质粒pK18-P_sod-CGS9114_RS08985导入重组谷氨酸棒杆菌MTL24，获得重组谷氨酸棒杆菌MTL25；

(6)好氧发酵合成L-鸟氨酸：

将步骤(3)-(6)中获得的重组谷氨酸棒杆菌MTL14、MTL16、MTL19、MTL21、MTL24和MTL25分别接种于鸟氨酸发酵培养基进行好氧发酵，6株重组谷氨酸棒杆菌分别按5-20v/v％接种量接种于鸟氨酸发酵培养基，控制摇床转速为250rpm，温度为32℃，发酵时间为48-72h，pH为6.8；

所述鸟氨酸发酵培养基包括甘露醇、酵母粉、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、Na₂HPO₄、FeSO₄、MnSO₄和CaCO₃；

发酵结束后收集发酵液，测定其发酵液上清中的鸟氨酸和甘露醇含量。

2.如权利要求1所述利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L-鸟氨酸产量的方法，其特征在于，步骤(6)中所述鸟氨酸发酵培养基中各组分的含量(g/L)为：甘露醇：0～100、酵母粉：6～20、(NH₄)₂SO₄：30～60、MgSO₄：2～5、KH₂PO₄：0.5～1.5、K₂HPO₄：0.5～1、Na₂HPO₄：0.5～1、FeSO₄：0.01～0.03、MnSO₄：0.01～0.03和CaCO₃：5～15。