[发明专利]一种利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L-鸟氨酸产量的方法

说明书

本发明公开了一种利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L‑鸟氨酸产量的方法，包括如下步骤：(1)获得靶点基因qsuR和CGS9114_RS08985和pdxR；(2)构建重组质粒pK18‑Psubgt;sod/subgt;‑qsuR、pK18‑Psubgt;sod/subgt;‑CGS9114_RS08985和pK18‑T‑pdxR；(3)构建重组谷氨酸棒杆菌MTL14、MTL16和MTL19；(4)构建重组谷氨酸棒杆菌MTL21和MTL24；(5)构建重组谷氨酸棒杆菌MTL25；(6)好氧发酵合成L‑鸟氨酸。本发明通过改造靶点基因，最终获得了具有最高L‑鸟氨酸产量的重组谷氨酸棒杆菌MTL25，进一步提高了L‑鸟氨酸的产量以及第三代生物质能源甘露醇的转化率。

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L-鸟氨酸产量的方法。

技术背景

L-鸟氨酸是尿素循环重要的中间体，对人体积累的有害氨具有解毒作用，可用于肝脏疾病的治疗。此外，由于L-鸟氨酸具有加快糖和脂肪消耗、调味以及增加聚乙烯胺物质生成的功能，因此被广泛应用于减肥保健、食品、医疗等领域。L-鸟氨酸的生产技术主要包括酶法、化学合成法、生物提取和微生物发酵法。其中酶法需要以价格较高的精氨酸为底物催化生产L-鸟氨酸，成本较高。化学合成法存在合成过程较为复杂、副产物多以及对环境破坏较大等缺点。生物提取法需要大量的生物体原材料，成本高，产率低，不利于工业化生产。而微生物发酵法则是以谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等微生物为生产菌株，利用葡萄糖、蔗糖和甘露醇等较为廉价的碳源为原料，通过菌种自身代谢系统合成L-鸟氨酸。相比于前三者，微生物发酵法具有原料廉价易得、污染小、对设备要求较低等优势，因而备受研究人员的青睐。谷氨酸棒杆菌已经被广泛应用于各类氨基酸的工业生产中，相比于其他生产菌株，谷氨酸棒杆菌是一种食品级的微生物，其产品被认证为GRAS安全级别，因此构建重组谷氨酸棒杆菌是生产L-鸟氨酸的最佳途径。

在发明人的前期工作中，发明人以谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株，利用同源重组技术，敲除负调控蛋白编码基因mtlR，使谷氨酸棒杆菌能够利用甘露醇生产L-鸟氨酸；在mtlD基因中插入强启动子P_NCgl0824，强化表达甘露醇脱氢酶基因，得到能够生产54.56g/L的L-鸟氨酸的重组谷氨酸棒杆菌MTL13(Sheng Q，Wu X，Jiang Y，et al.Highly efficientbiosynthesis of L-ornithine from mannitol by using recombinantCorynebacterium glutamicum[J].Bioresource Technology，2021，327(1)：124799)，但这一产量仍远低于目前利用葡萄糖为碳源的L-鸟氨酸产量。因此，利用甘露醇生产鸟氨酸的产量还有待进一步提高，以减少生产成本，更加适用于工业生产。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L-鸟氨酸产量的方法。

为达到以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇发酵提高L-鸟氨酸产量的方法，包括如下步骤：

(1)筛选遗传改造靶点基因：

分别用葡萄糖和甘露醇为唯一碳源，对谷氨酸棒杆菌MTL01进行培养，收集对数期样本进行转录组分析，获得基因表达差异详情表进行深度挖掘，设定p＜0.05阈值，挑选显著上下调基因，同时结合差异表达基因相关代谢途径分析得到3个可能对L-鸟氨酸产量有增益的靶点基因，包括2个显著上调基因qsuR和CGS9114_RS08985以及1个下调基因pdxR；

(2)构建重组质粒pK18-P_sod-qsuR、pK18-P_sod-CGS9114_RS08985和pK18-T-pdxR：