[发明专利]邻近碱基对增强型脱氧核酶和生物传感及生物传感器的应用

说明书

本发明公开了一种邻近碱基对增强型脱氧核酶和生物传感器及生物传感器的应用，增强型脱氧核酶的核苷酸序列G4‑AA、G4‑AG、G4‑A‑MdA、G4‑A‑AP、G4‑A‑dI中的一种；生物传感器包括增强型脱氧核酶、互补DNA链、大肠杆菌适配体和氯铁血红素。本发明通过改变G4邻近两位的碱基并根据沃森‑克里克碱基互补配对原则与邻近第二位杂交互补，进而增强DNAzyme的活性。基于增强型脱氧核酶的生物传感器，能特异性检测大肠杆菌，具有较高的检测灵敏度和回收率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种邻近碱基对增强型脱氧核酶和生物传感及生物传感器的应用。

背景技术

大肠杆菌是一种常见的食源性病原体，可导致人体出现溶血性尿毒症综合征、出血性结肠炎、急性肾损伤甚至死亡等现象。食源性大肠杆菌暴发与食用受污染的食物有关，例如新鲜蔬菜、酸性饮料和碎牛肉。因此，对食品中大肠杆菌检测是食品安全检测中的重要一环。传统检测大肠杆菌的方法以微生物培养为代表，尽管能依据形态特征、生长特性等特异性鉴别菌种，但是操作过程繁琐，耗时较长，一般情况下检测时间需要数天，且容易被空气中的微生物污染。随着科研人员对微生物检测的关注，仪器分析、分子生物学、以及免疫学等技术在微生物检测中的应用出现大家的视野里，在一定程度上解决了传统微生物检测方法的耗时长、容易污染等问题，但是以上方法存在操作复杂、成本较高、特异性低以及灵敏度低等不足，导致检测结果不稳定。因此，开发一种经济实惠、简单快速、灵敏度较高的检测方式尤为重要。目前，生物传感器因检测速度快、经济实惠等优势被大家所熟知，但是现有方法存在灵敏度低，检测背景高等不足。

为了提高生物传感器在检测过程中的灵敏度，通常会加入具有催化功能的酶，加速氧化还原反应，将生化反应转化为荧光、比色、电化学信号。传统上用于催化的酶大部分为蛋白质酶，如常用于生物传感领域的辣根过氧化物酶，尽管其具有较高的催化活性，但存在保存要求高、酶活不稳定等缺点。然而，类似辣根过氧化物酶催化活性的脱氧核酶(DNAzyme，由富含G(鸟嘌呤)的DNA单链和hemin组成)具有体积较小，容易合成等优势，有望取代辣根过氧化物酶在生物传感中的位置。但是，在实际应用中发现脱氧核酶的活性并不高，达不到辣根过氧化物酶的活性。以往为了增强脱氧核酶的活性会通过序列筛选、修饰G4骨架、添加活性激活剂，添加侧翼序列等方式筛选高催化活性的脱氧核酶，这些方式为提高脱氧核酶活性提供了具有参考意义的思路，即使如此，脱氧核酶活性倍数远不及辣根过氧化物酶。因此，如何提高脱氧核酶活性是生物传感应用于检测中必须要考虑的重要因素之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种邻近碱基对增强型脱氧核酶，并基于该脱氧核酶构建检测大肠杆菌的生物传感器，最终应用于大肠杆菌检测。

为了实现上述目的，本发明提供了一种邻近碱基对增强型脱氧核酶，所述增强型脱氧核酶的核苷酸序列G4-AA、G4-AG、G4-A-MdA、G4-A-AP、G4-A-dI中的一种；

所述G4-AA的核苷酸序列为：G4-AA-TTTCGCTATGTCTG；

所述G4-AG的核苷酸序列为：G4-AG-TTTCGCTATGTCTG；

所述G4-A-MdA的核苷酸序列为：G4-A-/6-med a/-TTTCGCTATGTCTG；(/6-med a/为N6’甲基化腺嘌呤)；

所述G4-A-AP的核苷酸序列G4-A-/i2-amp/-TTTCGCTATGTCTG；(/i2-amp/为2’氨基嘌呤)；

所述G4-A-dI的核苷酸序列G4-A-/6-ide oxy i/-TTTCGCTATGTCTG。(/6-ide oxyi/为次黄嘌呤)。

上述的邻近碱基对增强型脱氧核酶，进一步的，所述G4的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。