[发明专利]ApoA5基因敲除仓鼠模型的构建方法

说明书

本发明适用于疾病动物模型构建领域，提供了ApoA5基因敲除仓鼠模型的构建方法，包括以下步骤：设计仓鼠ApoA5基因特异性打靶序列，制备cas9mRNA和sgRNA；收集和培养仓鼠受精卵；显微注射：将所述sgRNA和cas9mRNA共同注射至仓鼠受精卵的细胞质中；将显微注射后的受精卵植入代孕仓鼠体内，F0代仓鼠出生。本发明利用最新的CRISPR/Cas9基因编辑技术在拟人化仓鼠模型上敲除ApoA5基因，构建新型可模拟人类高甘油三酯血症的动物模型，探究ApoA5在高甘油三酯血症与动脉粥样硬化疾病中的作用。

技术领域

本发明属于疾病动物模型构建领域，尤其涉及ApoA5基因敲除仓鼠模型的构建方法。

背景技术

载脂蛋白A5(apolipoprotein A5，ApoA5)(gene ID：116519；OMIM accessionnumber：606368)是2001年Rubin等人通过比对人和小鼠调控胆固醇和甘油三酯代谢的ApoA1/A5/A4基因簇编码序列时确认的一个载脂蛋白家族新成员，位于人类11号染色体长臂q23区域，ApoA4基因簇下游30kbp位置。该基因全长1889bp，包含4个外显子和3个内含子，其起始密码子在第2外显子上，可编码366个氨基酸残基。人ApoA5蛋白由343个氨基酸组成，分子量约为39kD，呈高疏水性，主要在肝脏合成，极少量来源于小肠。在血浆中，ApoA5存在于乳糜微粒(chylomicron，CM)、LDL和HDL中，但含量很低，约为0.1-0.4mg/mL，仅为血浆ApoB蛋白含量的千分之一。

早在2001年美国研究人员即发现在小鼠体内敲除ApoA5基因后，小鼠血浆甘油三酯仅升高2-4倍(150-350mg/dl)，并没有展现出与人类ApoA5缺陷相似的极度高甘油三酯血症，无法模拟临床病人的甘油三酯代谢特征；然而在小鼠体内过表达ApoA5，小鼠血浆甘油三酯降低约1/3，并且无论过表达还是敲除ApoA5均对小鼠血浆胆固醇水平无显著影响，提示ApoA5可以负向调控血浆甘油三酯水平。

目前，推测其对血浆甘油三酯代谢的调控可能通过三条途径：(1)LPL的激动剂，通过促进富含甘油三酯的脂蛋白(triglycerides-rich lipoprotein，TRL)颗粒与血管内皮细胞表面的糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白结合蛋白1(glycosylphosphatidylinositolanchored high density lipoprotein binding protein 1，GPIHBP1)或硫酸肝素蛋白聚糖(heparin sulphate proteoglycans，HSPG)的结合，促进TRL水解；(2)抑制肝脏极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)分泌；(3)通过和低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员结合促进肝脏对残体脂蛋白的摄取。但是，ApoA5是否还存在其他的甘油三酯调控机制目前仍然不清楚。

因此，针对以上现状，迫切需要开发ApoA5基因敲除仓鼠模型的构建方法，以克服当前实际应用中的不足。

发明内容

本发明的目的在于提供ApoA5基因敲除仓鼠模型的构建方法，旨在解决上述背景中提到的问题。

本发明是这样实现的，ApoA5基因敲除仓鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤一、设计仓鼠ApoA5基因特异性打靶序列，制备cas9 mRNA和sgRNA；

步骤二、收集和培养仓鼠受精卵；

步骤三、显微注射：将所述sgRNA和cas9 mRNA共同注射至仓鼠受精卵的细胞质中；

步骤四、将显微注射后的受精卵植入代孕仓鼠体内，F0代仓鼠出生。